色氨酸操纵子的基本结构
一些G+菌,如枯草杆菌
色氨酸操纵子的结构有所不同,7 个
结构基因中的6 个依次排列为trpEDCFBA,存在于含有12个结构基因的
芳香族氨基酸超操纵子( a ro operon ),第7 个结构
基因,trpG存在于叶酸合成操纵子中,该酶参与Trp 和叶酸的合成。有2个
启动子参与调控,一个位于aro operon的起始位置,另一个则位于trpE 上游约200 bp处。
色氨酸操纵子的调控作用途径
Trp合成途径较漫长,消耗大量能量和前体物,如丝氨酸、PRPP、谷
氨酰氨等,是细胞内最昂贵的
代谢途径之一,因此受到严格调控,其中
色氨酸操纵子发挥着关键作用。调控作用主要有三种方式:阻遏作用、
弱化作用以及终产物Trp 对
合成酶的反馈抑制作用。
阻遏作用
trp操纵子转录起始的调控是通过
阻遏蛋白实现的。产生
阻遏蛋白的
基因是trpR,该基因距trp o2peron
基因簇很远。它结合于trp
操纵基因特异序列,阻止
转录起始。但
阻遏蛋白的DNA结合活性受Trp调控,Trp起着一个效应分子的作用,Trp与之结合的动力学常数为1~2 ×10- 5mol·L - 1。在有高浓度Trp存在时,
阻遏蛋白-
色氨酸复合物形成一个同源二聚体,并且与色氨酸
操纵子紧密结合,因此可以阻止
转录。
阻遏蛋白-
色氨酸复合物与
基因特异位点结合的能力很强,动力学常数为2 ×10- 10mol·L - 1,因此细胞内阻遏蛋白数量仅有20~30分子已可充分发挥作用。当Trp 水平低时,
阻遏蛋白以一种非活性形式存在,不能结合DNA。在这样的条件下,trp
操纵子被RNA聚合酶
转录,同时Trp
生物合成途径被激活。
弱化作用
trp操纵子转录终止的调控是通过
弱化作用( attenuation)实现的。在
大肠杆菌trp operon,
前导区的碱基序列包括4个分别以1、2、3和4表示的片段,能以两种不同的方式进行
碱基配对,1 - 2和3 -4配对,或2 - 3配对,3 - 4配对区正好位于
终止密码子的识别区。
前导序列有相邻的两个色氨酸
密码子,当培养基中Trp 浓度很低时,负载有Trp 的tR2NATrp也就少,这样翻译通过两个相邻色氨酸密码子的速度就会很慢,当4区被
转录完成时,核糖体滞留1区,这时的
前导区结构是2 - 3配对,不形成3 - 4配对的终止结构,所以转录可继续进行。反之,核糖体可顺利通过两个相邻的色氨酸
密码子,在4区被
转录之前,核糖体就到达2区,这样使2 - 3不能配对,3 - 4 区可以配对形成
终止子结构,转录停止。
枯草杆菌的
弱化作用机制另有特点。因其
色氨酸操纵子结构的特殊性,
转录起始的调节似乎不如
转录终止的调节更具重要性。枯草杆菌
色氨酸操纵子表达主要受到色氨酸激活
RNA结合蛋白( Trp -activated RNA - binding p rotein,TRAP)的调节。该蛋白与色氨酸结合被激活后,可与trpE上游
转录产物结合,导致
转录终止。当色氨酸浓度较低时,TRAP失活,
转录可以继续,
结构基因得以表达。另外枯草杆菌对未负荷色氨酸的tRNATrp也很敏感,后者大量堆积,会诱导合成抗TRAP 蛋白( anti -PRAP,AT)。AT与Trp激活的PRAP结合,可以取消其转录终止活性。trpG表达也受PRAP调控,活化的TRAP与和trpG相重叠的S - D 序列结合,阻碍核糖体的结合,抑制trpG
转录。
反馈抑制作用
由于
基因表达必然消耗一定的能源和前体物,相对于阻遏和
弱化作用,反馈抑制作用更为经济和高效。终产物Trp对催化分支途径几步反应的酶具有反馈抑制作用,其50%抑制浓度分别为:
邻氨基苯甲酸合酶,0. 0015 mmol·L - 1 ;邻氨基苯甲酸磷酸核糖
转移酶,0. 15 mmol·L - 1 ;
色氨酸合成酶,7. 7mmol·L - 1。对于普通野生
菌株,
邻氨基苯甲酸合酶对Trp合成起到关键调控作用,常被称为瓶颈酶;但对高产Trp工程菌而言,上述任何一种酶的
反馈抑制都会直接影响Trp产量。研究发现
酶蛋白某些特殊位点突变可以导致对
反馈抑制作用敏感性显著下降,如
邻氨基苯甲酸合酶38位的丝氨酸被
精氨酸取代,抗
反馈抑制能力显著提高,当环境中Trp浓度为10 mmol·L - 1时
酶活性不受影响,而相同条件下野生型酶活性不到1%。邻氨基苯甲酸磷酸核糖
转移酶162位
缬氨酸被
谷氨酸取代,抗
反馈抑制能力也有显著提高,当环境中含有0. 83 mmol·L - 1色氨酸或0. 32 mmol·L - 1 5 -
甲基- 色氨酸时,
酶活性分别为野生菌的3. 6倍和2. 4倍。陈小芳等报道一株
谷氨酸棒杆菌
邻氨基苯甲酸合酶
基因7个碱基突变导致6个
氨基酸残基改变,抗反馈抑制能力显著增强,环境中Trp 浓度达到15 mmol·L - 1时,邻氨基苯甲酸合
酶活性几乎没有变化。
色氨酸操纵子遗传改造
由于
色氨酸操纵子的调控作用,自然界不可能存在高产Trp
菌株,为了获得高产Trp菌株,就必须对色氨酸操纵子进行改造,解除其调节作用。早期的研究策略主要依靠传统诱变方法,经过长期努力,获得了一些有价值的研究结果,如获得了TrpR - 菌株,通过缺失某些片断解除了
弱化作用,得到了一些抗反馈抑制的酶。许多Trp生产菌株都是通过随机的诱变技术筛选得到的,如
王健等通过硫酸二乙酯诱变,Trp 类似物筛选等方法从
谷氨酸棒杆菌中培育出一株trp 高产
菌株,摇瓶发酵64 h,产trp达到7. 28 g·L - 1。
传统诱变的方法尽管有效,但其缺陷点也是显而易见的,如工作量大,效率低,
突变株的菌体生长、对环境的耐受性以及遗传稳定性等都比
野生型菌株差等。基因工程技术的建立和发展对
色氨酸操纵子改造提供了新的技术平台。1979年Tribe等人采用DNA重组技术对
大肠杆菌进行改造,扩增trp
操纵子,发酵12 h,产酸1 g·L - 1,产酸量尽管不是很高,但是其意义却十分重大,由此开创了
基因工程技术在Trp
生物合成应用的先河。随后,Aiba等将带有
色氨酸操纵子的质粒引入
大肠杆菌,发酵27 h,并补充
邻氨基苯甲酸,得到trp 6. 2 g·L - 1。Ikeda等通过构建稳定质粒,扩增分支途径
限速酶并改造中心
代谢途径,获得产Trp 达58 mg ·L - 1 的
菌株。除了扩增表达
操纵子基因,对其进行理性设计和改造也开始引起关注。已知酶分子某些特殊位点突变可以导致对反馈抑制作用敏感性下降,因此可以考虑利用基因工程技术对
色氨酸操纵子结构基因进行理性改造降低其对反馈抑制的敏感性,但是目前尚缺乏成功的范例,主要原因在于现有酶分子反馈抑制结构与功能关系资料不足,不能满足需要。
代谢工程理论与色氨酸操纵子调控研究
1991年,Bailey用代谢工程描述利用DNA重组技术对细胞的酶反应、物质运输以及调控功能的
遗传操作,进而改良细胞生物活性的过程,标志着代谢工程向一门系统学科发展的转折点。代谢工程亦称途径工程,以区别于传统的单
基因表达(第一代基因工程)和基因定向突变(
第二代基因工程),是有目的地对细胞
生化反应的
代谢网络进行修饰的技术,在多基因水平上设计修饰细胞固有的
代谢途径和遗传性状,并赋予细胞更为优越甚至崭新的产物生产品质。代谢工程在提高
宿主细胞原有
代谢物的产量、产生新物质、扩展和构建新
代谢途径、生产代谢产物如
氨基酸、抗生素、维生素以及降解
环境污染物等诸多方面显示出广阔的应用前景。从理论上提高Trp产率是
代谢工程的首要任务,这需要对Trp
生物合成和对细胞内控制Trp 代谢的异化途径有很好的了解,同时还要有一个在较宽的
微生物代谢网络内描述这些途径的有效的数学模型。早期的模型主要考虑
色氨酸操纵子动力学的某个方面,仅有少数研究模型,综合考虑了色氨酸操纵子的三种作用机制。
修志龙等将
代谢工程理论引入trp代谢分析领域,建立了适宜的数学模型,发现在代谢稳定的条件下,阻遏水平和酶的
反馈抑制强度严重地影响了目标变量,即trp 浓度。Santillan等人提出的动力模型采用Second Lyapunov’s method分析,通过对野生菌株和几株改良菌株(
邻氨基苯甲酸合成酶反馈抑制和
弱化作用分别解除)的性能进行比较、验证,得出结论认为酶的反馈抑制对于系统稳定性具有重要作用,而弱化作用影响较小,主要在Trp营养发生改变时发生作用。这两个模型有一定的代表性,它们考虑了酶的反馈抑制,对于Trp
生物合成具有一定指导意义;但其不足也很明显,仅仅考虑了
邻氨基苯甲酸合成酶的反馈抑制作用,对其它酶未作考虑,另外一个不足是缺乏高产色氨酸菌株来加以验证。