目的DNA片段的获得
DNA克隆的第一步是获得包含
目的基因在内的一群DNA分子,这些DNA分子或来自于目的生物
基因组DNA或来自目的细胞mRNA
逆转录合成的
双链cDNA分子。由于
基因组DNA较大,不利于克隆,因此有必要将其处理成适合克隆的DNA小片段,常用的方法有机械切割和核酸
限制性内切酶消化。若是
基因序列已知而且比较小就可用人工化学直接合成。如果
基因的两端部分序列已知,根据已知序列设计
引物,从基因组DNA 或cDNA中通过PCR技术可以获得
目的基因。
载体的选择
基因工程的载体应具有一些基本的性质:1)在
宿主细胞中有独立的复制和表达的能力,这样才能使外源重组的DNA片段得以扩增。2)分子量尽可能小,以利于在
宿主细胞中有较多的拷贝,便于结合更大的外源DNA片段。同时在实验操作中也不易被机械剪切而破坏。3)载体分子中最好具有两个以上的容易检测的
遗传标记(如抗药性
标记基因),以赋予
宿主细胞的不同表型特征(如对
抗生素的抗性)。4)载体本身最好具有尽可能多的限制酶单一切点,为避开外源DNA片段中限制酶位点的干扰提供更大的选择范围。若载体上的单一
酶切位点是位于检测表型的标记
基因之内可造成
插入失活效应,则更有利于
重组子的筛选。
体外重组
体外重组即体外将目的片断和载体分子连接的过程。大多数核酸
限制性内切酶能够切割DNA分子形成有
粘性末端,用同一种酶或
同尾酶切割适当载体的
多克隆位点便可获得相同的粘性末端,粘性末端彼此退火,通过T4 DNA
连接酶的作用便可形成
重组体,此为粘末端连接。当目的DNA片断为
平端,可以直接与带有平端载体相连,此为
平末端连接,但连接
效率比粘端相连差些。有时为了不同的克隆目的,如将
平端DNA分子插入到带有粘末端的表达载体实现表达时,则要将平端DNA分子通过一些修饰,如同聚物
加尾,加衔接物或人工接头,PCR法引入酶切位点等,可以获得相应的粘末端,然后进行连接,此为修饰粘末端连接。
导入受体细胞
载体DNA分子上具有能被原核宿主细胞识别的复制起始位点,因此可以在原核细胞如
大肠杆菌中复制,重组载体中的
目的基因随同载体一起被扩增,最终获得大量同一的重组DNA分子。
将外源重组DNA分子导入原核
宿主细胞的方法有转化(transformation),转染(transfection),转导(transduction)。
重组质粒通过转化技术可以导入到
宿主细胞中,同样重组
噬菌体DNA可以通过转染技术导入。转染效率不高,因此将重组噬菌体 DNA或柯斯
质粒体外包装成有浸染性的噬菌体颗粒,借助这些噬菌体颗粒将重组DNA分子导入到
宿主细胞转导技术,这种转导技术的导入效率要比转染的导入效率高。
重组子的筛选
从不同的重组DNA分子获得的
转化子中鉴定出含有
目的基因的转化子即
阳性克隆的过程就是筛选。发展起来的成熟筛选方法如下:
(二)PCR筛选和限制酶酶切法
获得目的
基因表达的蛋白抗体,就可以采用免疫学
筛选法获得目的基因克隆。这些抗体即可是从生物本身纯化出目的基因表达蛋白抗体,也可从目的基因部分ORF片段克隆在
表达载体中获得表达蛋白的抗体。
上述方法获得的阳性克隆最后要进行测序分析,以最终确认
目的基因。