由于具有螺旋结构的双链各自闭合，结果使整个DNA分子进一步旋曲而形成三级结构。自然界中主要是负超螺旋.另外如果一条或二条链的不同部位上产生一个断口，就会成为无旋曲的开环DNA分子。从细胞中提取出来的质粒或病毒DNA都含有闭环和开环这二种分子。可根据两者与色素结合能力的不同，而将两者分离开来。

在双螺旋结构中，每旋转一圈含有10个碱基对处于能量最低的状态，少于10个就会形成右手超螺旋（顺时针），反之为左手超螺旋（逆时针）。前者称为负超螺旋（与DNA双螺旋的旋转方向相反的扭转），后者称为正超螺旋（与DNA双螺旋的旋转方向相同的扭转）。这是一种三级构造。原核细胞中的DNA超螺旋是在DNA旋转酶作用下，由ATP提供能量形成的环状DNA负超螺旋，真核细胞中的DNA与组蛋白形成的核小体以正超螺旋结构存在。DNA超螺旋有两种存在形式：具绞旋线超螺旋以及螺管式超螺旋。具绞旋线是发生在当DNA从细胞中独立出来后形成的超螺旋状态，而螺管式则是当DNA处于染色质中维持的超螺旋状态。其中以螺管式缠绕的更加紧密，且需要蛋白质的辅助方能形成——染色质中组蛋白。

扭转数（T；twisting number）缠绕数（W；writhing number）与连环数（L；Linking number）之间的关系可写成：

L = T + W

其中，L（连环数）定义为当一个环状双螺旋DNA分子平铺在平面时，一条链跨越另一条链的次数，T（扭转数），指一条链绕双螺旋假想轴缠绕的圈数，W（缠绕数）亦称为超螺旋数（Number Of Turns Of Superhelix）