荧光素漏出试验( the fluorescein leakage test, FLT)是欧洲近年发展的评价兔眼刺激性的一种替代方法,它通过检测暴露于受试物后渗透过培养的单/多层细胞荧光素量来评价受试物的刺激性,并用于评价受试物对细胞屏障功能的影响。FLT在欧洲获得了大量的验证研究,被认为是一极有意义的试验方法。 FLT方法与结果判定 确定MDCK细胞生长融合后,于细胞生长培养膜内单层细胞表面加入0.4 ml受试物, 15 min后用Hank′s液轻柔冲洗细胞表面以清除受试物,再将细胞生长培养膜放入每孔含0.5 ml新鲜配制Hank′s液的培养板中,加入0.4 ml浓度为10μg/ml荧光素钠溶液, 37℃培养30 min后以荧光分光光度计检测渗透入培养板中的荧光素量(激发光波长485 nm,发射光波长530 nm)。然后,清洗细胞生长培养膜,置于另一含有新鲜培养液的培养板上,于37℃继续培养4 h后,再次加入荧光素钠溶液,同法检测以了解受试物对细胞紧密连接的影响。如此,依次检测24 h和72 h受试物对细胞的影响。 按以下公式计算引起荧光素漏出百分比: FL(% )=(m-y)/(z-y)×100% m表示各受试物各浓度荧光素漏出量均值, y表示无受试物对照组荧光素漏出量均值(阴性对照), z表示无细胞培养对照组荧光素漏出量均值(阳性对照)。 计算接触受试物后引起20%荧光素漏出的实验物质浓度FL20(g/100 ml),并根据4 h结果FL20H4将受试物分为3 个刺激性等级,其中FL20H4>10 g/100 ml为无/轻刺激、2~10 g/100 ml为中刺激、<2 g/100 ml为重/极重刺激。