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光脱色荧光恢复技术

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  fluorescence recovery after photobleaching

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用光脱色荧光恢复技术 fluorescence recovery after photobleaching

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光脱色荧光恢复技术

光脱色荧光恢复技术(fluorescence recovery after photobleaching FRAP) 这种方法不仅能够证明膜的流动性,同时也能测量膜蛋白扩散的速率。 研究膜流动性的一种方法。首先用荧光物质标记膜蛋白或膜脂, 然后用激光束照射细胞表面某一区域, 使被照射区域的荧光淬灭变暗形成一个漂白斑。由于膜的流动性,漂白斑周围的荧光物质随着膜蛋白或膜脂的流动逐渐将漂白斑覆盖,使淬灭区域的亮度逐渐增加, 最后恢复到与周围的荧光光强度相等.细胞膜蛋白的标记方法有很多种。可以用非特异性的染料,如异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)将细胞膜蛋白全部进行标记。也可用特异性的探针,如荧光抗体,标记特异的膜蛋白。膜蛋白一旦被标记就可用激光束进行局部照射处理,使荧光脱色,形成直径约为1μm 的白斑。若是可移动的膜蛋白,则会因蛋白的移动,使白斑消失,若是不能移动的蛋白.则白斑不会消失。根据荧光恢复的速度, 可推算膜脂的扩散速度为每秒钟为几个微米,而膜蛋白的扩散速度变化幅度较大,少数膜蛋白的扩散速度可达到膜脂的速度,大多数蛋白的扩散速度都比膜脂慢,还有一些膜蛋白完全限于某一个区域。正是这种限制,使膜形成一些特定的膜微区(membrane domain),这些微区具有不同的蛋白组成和功能。这实际上是膜蛋白不对称分布带来膜功能的不对称。

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