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DNA聚合酶(DNApolymeraseI)最早于1955年发现,而较具有实验价值及实用性的KlenowfragmentofE.Coli则是于70年代的初期由Dr.H.Klenow所发现,但由于此酶不耐高温,高温能使之变性,因此不符合使用高温变性的聚合酶链式反应。现今所使用的酶(简称Taqpolymerase),则是于1976年从温泉中的细菌(Thermusaquaticus)分离出来的。

化学信息

基本信息

中文名称: 脱氧核糖核酸
中文别名: DNA酶
英文名称: deoxyribonuclease,DNase I
英文别名: DNAase,Deoxyribonucleate 5′-oligonucleotido-hydrolase
纯度: ≥2,000 Kunitz units/mg protein
CAS号: 9003-98-9

性状描述

灰色至类白色粉末。

用途说明

用于改造蛋白样品中的DNA。

贮存条件

-20℃储存。

危险说明

安全等级:S22-24/25

简介

Skaggs 化学生物学院的 Gerald F. Joyce 教授领导的研究组,利用体外演化的方法将RNA 酶转化成了DNA酶,这将有助于了解有关生命的一个最基本问题,即生命如何由RNA世界演化为今天的以DNA和蛋白质为基础的细胞形式。
新研究显示RNA酶要转化成具有同等功能的为 DNA酶,仅仅需要少数几个关键变异的演化步骤。
地球早期生命的基因信息与催化功能都是依靠RNA来完成。这项研究也揭示出这种RNA 转变为 DNA 过程的演化路径可能也存在于其它与核酸相似的物质中。因此,这项研究的新发现将有助于了解生命基础结构以及其如何演化。
许多可能是原始前RNA的分子都具有能与自身和RNA形成碱基配对结构的能力。新的研究则显示,RNA酶演化改变为具相同催化功能的DNA酶(deoxyribozyme)可能是通过随机变异和选择而产生的。
这项研究以体外演化方式将RNA核酸酶转化成相对应的脱氧核糖核酸酶。Ribozyme 首先利用与 RNA 相同序列、但不具催化活性的DNA 分子组成。在加入大量含随机变异的DNA 分子并进行体外演化后,DNA酶获得与最初 ribozyme 相同的酶活性。
这种体外演化方式能提供快速将ribozyme 转化为相对应DNA核醣酶体。该研究通过在实验室内进行多个世代的演化获得的信息还将可能用于治疗与诊断等领域DNA聚合酶(DNApolymeraseI)最早于1955年发现,而较具有实验价值及实用性的KlenowfragmentofE.Coli则是于70年代的初期由Dr.H.Klenow所发现,但由于此酶不耐高温,高温能使之变性,因此不符合使用高温变性的聚合酶链式反应。现今所使用的酶(简称Taqpolymerase),则是于1976年从温泉中的细菌(Thermusaquaticus)分离出来的。它的特性就在于能耐高温,是一个很理想的酶,但它被广泛运用则于80年代之后。PCR最初的原始雏形概念是类似基因修复复制,它是于1971年由Dr.KjellKleppe提出。他发表了第一个单纯且短暂性基因复制(类似PCR前两个周期反应)的实验。而现今所发展出来的PCR则于1983由Dr.KaryB.Mullis发展出的,Dr.Mullis当年服务于PE公司,因此PE公司在PCR界有着特殊的地位。Dr.Mullis并于1985年与Saiki等人正式表了第一篇相关的论文。此后,PCR的运用一日千里,相关的论文发表质量可以说是令众多其它研究方法难望其项背。随后PCR技术在生物科研和临床应用中得以广泛应用,成为分子生物学研究的最重要技术。Mullis也因此获得了1993年诺贝尔化学奖。

PCR原理

DNA的半保留复制生物进化传代的重要途径。双链DNA在多种酶的作用下可以变性解链成单链,在DNA聚合酶与启动子的参与下,根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子挎贝。在实验中发现,DNA在高温时也可以发生变性解链,当温度降低后又可以复性成为双链。因此,通过温度变化控制DNA的变性和复性,并设计引物做启动子,加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。
但是,DNA聚合酶在高温时会失活,因此,每次循环都得加入新的DNA聚合酶,不仅操作烦琐,而且价格昂贵,制约了PCR技术的应用和发展。发现耐热DNA聚合同酶--Taq酶对于PCR的应用有里程碑的意义,该酶可以耐受90℃以上的高温而不失活,不需要每个循环加酶,使PCR技术变得非常简捷、同时也大大降低了成本,PCR技术得以大量应用,并逐步应用于临床。

PCR过程

1.DNA变性(90℃-96℃):双链DNA模板在热作用下,氢键断裂,形成单链DNA.退火(25℃-65℃):系统温度降低,引物与DNA模板结合,形成局部双链。
3.延伸(70℃-75℃):在Taq酶(在72℃左右最佳的活性)的作用下,以dNTP为原料,从引物的5′端→3′端延伸,合成与模板互补的DNA链。
每一循环经过变性、退火和延伸,DNA含量既增加一倍。
现在有些PCR因为扩增区很短,即使Taq酶活性不是最佳也能在很短的时间内复制完成,因此可以改为两步法,即退火和延伸同时在60℃-65℃间进行,以减少一次升降温过程,提高了反应速度
〔PCR检测〕PCR反应扩增出了高的拷贝数,下一步检测就成了关键。荧光素溴乙锭)染色凝胶电泳是最最常用的检测手段。电泳法检测特异性是不太高的,因此引物两聚体等非特异性的杂交体很容易引起误判。但因为其简捷易行,成为了主流检测方法。近年来以荧光探针为代表的检测方法,有逐渐取代电泳法的趋势。
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- 来自原声例句
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