变性凝胶电泳 百科内容来自于: 百度百科

简介

变性凝胶电泳(denaturing gel electrophoresis)最初是Lerman等人于20世纪80年
变性梯度凝胶电泳系统
代初期发明的,起初主要用来检测DNA片段中的点突变。Muyzer等人在1993年首次将其应用于微生物群落结构研究。后来又发展出其衍生技术,温度梯度凝胶电泳(temperaturegradientgelelectrophoresis,TGGE)。此后十年间,该技术被广泛用于微生物分子生态学研究的各个领域,目前已经发展成为研究微生物群落结构的主要分子生物学方法之一。

原理

双链DNA分子在一般的聚丙烯酰胺凝胶电泳时,其迁移行为决定于其分子大小和电荷。不同长度的DNA片段能够被区分开,但同样长度的DNA片段在胶中的迁移行为一样,因此不能被区分。DGGE/TGGE技术在一般的聚丙烯酰胺凝胶基础上,加入了变性剂(尿素和甲酰胺)梯度,从而能够把同样长度但序列不同的DNA片段区分开来。一个特定的DNA片段有其特有的序列组成,其序列组成决定了其解链区域(meltingdomain,MD)和解链行为(meltingbehavior)。一个几百个碱基对的DNA片段一般有几个解链区域,每个解链区域有一段连续的碱基对组成。当变性剂浓度逐渐增加达到其最低的解链区域浓度时,该区域这一段连续的碱基对发生解链。当浓度度再升高依次达到各其他解链区域浓度时,这些区域也依次发生解链。直到变性剂浓度达到最高的解链区域浓度后,最高的解链区域也发生解链,从而双链DNA完全解链。
不同的双链DNA片段因为其序列组成不一样,所以其解链区域及各解链区域的解链浓度也是不一样的。当它们进行DGGE时,一开始变性剂浓度比较小,不能使双链DNA片段最低的解链区域解链,此时DNA片段的迁移行为和在一般的聚丙烯酰胺凝胶中一样。然而一旦DNA片段迁移到一特定位置,其变性剂浓度刚好能使双链DNA片段最低的解链区域解链时,双链DNA片段最低的解链区域立即发生解链。部分解链的DNA片段在胶中的迁移速率会急剧降低。因此,同样长度但序列不同的DNA片段会在胶中不同位置处达到各自最低解链区域的解链浓度,因此它们会在胶中的不同位置处发生部分解链导致迁移速率大大下降,从而在胶中被区分开来。然而,一旦变性剂浓度达到DNA片段最高的解链区域温度时,DNA片段会完全解链,成为单链DNA分子,此时它们又能在胶中继续迁移。因此如果不同DNA片段的序列差异发生在最高的解链区域时,这些片段就不能被区分开来。在DNA片段的一端加入一段富含GC的DNA片段(GC夹子,一般30-50个碱基对)可以解决这个问题。含有GC夹子的DNA片段最高的解链区域在GC夹子这一段序列处,它的解链浓度很高,可以防止DNA片段在DGGE胶中完全解链。当加了GC夹子后,DNA片段中基本上每个碱基处的序列差异都能被区分开。
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- 来自原声例句
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