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免疫电镜(immunoelectron microscopy)技术是免疫化学技术与电镜技术结合的产物,是在超微结构水平研究和观察抗原、抗体结合定位的一种方法学。它主要分为两大类:一类是免疫凝集电镜技术,即采用抗原抗体凝集反应后,再经负染色直接在电镜下观察;另一类则是免疫电镜定位技术。 免疫电镜的应用,使得抗原和抗体定位的研究进入到亚细胞的水平。

原理

该项技术是利用带有特殊标记的抗体与相应抗原相结合,在电子显微镜下观察,由于标准物形成一定的电子密度而指示出相应抗原所在的部位。
根据标记方法的不同, 分为免疫铁蛋白技术免疫酶标技术免疫胶体金技术。如免疫铁蛋白技术是将含铁蛋白通过一种低分子量的双功能试剂与抗体结合,成为一种双分子复合物,它既保留抗体的免疫活性,又具有电镜下可见的高电子密度铁离子核心,因此用铁蛋白标记的抗体可通过电镜免疫化学的方法在电镜下定位细胞中的抗原。

影响免疫电镜的一些因素

1.标记物用于电镜观察的标记物有三类:一类是电子密度致密的标记物,如铁蛋白辣根过氧化物酶等。另一类则是放射性同位素,如I、S、P、C、H等,第三类则是有独特形状的标记物,如血兰蛋白、噬菌体等。对标记物的要求是:具有特定的形状、不影响抗原抗体复合物的特性与形状。目前用于免疫电镜的标记物主要是铁蛋白和HRP。两者各有其优点,铁蛋白电子密度致密。观察时反差大,优于酶标记,但铁蛋白分子量大(460 000),穿透能力差,所以适于细胞表面抗原的定位,另外铁蛋白的标记过程比较复杂。HRP分子量小(40 000),穿透力强,有利于标记抗体进入细胞内,适于细胞内的抗原定位。
2.固定剂固定是免疫电镜较关键的一步,免疫电镜中的固定与一般超薄切片中的固定的不同之点在于既考虑保存细胞的超微结构,又要考虑到抗原的失活性问题。
(1)固定剂的要求:①不损害细胞内抗原的活性;②固定速度快、效果好;③分子量小,易于渗透;④固定后,不引起交联,造成空间的阻碍,影响标记抗体进入抗原位。
(2)影响固定的因素有:①采用固定剂的种类;②固定剂的浓度,浓度过大,对抗原的活性有影响,浓度过小,固定效果差;③固定剂的pH;④固定剂的温度,一般采用2℃~4℃冷固定;这样能降低细胞的自浴作用和水分的抽提;⑤固定时间与温度有关,温度高,固定快,也与缓冲系的离子强度有关,离子强度大,渗透压大,穿透力强,固定要快。不同的固定剂,或同一固定剂的不同浓度所需的固定时间也不一致;⑥与被固定的细胞类型有关。目前常用的固定系统有:4%聚甲醛,1.5%~2%戊二醛,1%多聚甲醛+1%戊二醛,4%多聚甲醛+0.5%苦味酸+0.25%戊二醛,96%乙醇+1%醋酸。不论采用哪些系统,使用前必须用已知效价的抗原做一系列预实验。如固定剂的种类浓度、温度、pH及固定时间等。然后做出预处理的效价,作为失活参考以再选择最适条件。
例如由于某些固定技术(如锇酸固定)对抗体抗原的结合有干扰,因此应采取较为温和的样品制备方法。
3.非特异性吸附 非特异性吸附与酶标抗体、抗血清的稀释度、染色时间,温度及介质等有关,其中最主要的是抗血清及标记抗体的稀释。一般认为高效价抗血清或标记抗体稀释到低蛋白浓度,用于标记染色可获得最理想的结果。因为低蛋白浓度有利于降低非特异性吸附。实际应用的蛋白浓度大致在0.50mg/ml~2mg/ml。工作效价一般在1︰20~1︰400,在实际工作中,将标记抗体或抗血清稀释到1︰100倍以上则可获得理想的阳性结果,而非特异性吸附必然降得很低。工作浓度的选择是将标记抗体或抗血清作1︰2、1︰4、1︰8……1︰256的稀释,做已知阳性标本的标记染色观察,取其阳性沉积物明显,而非特异性吸附最低的一稀释度做为工作浓度。4.标记染色法 标记染色法分为直接染色法与间接染色法两种。前者的特点是特异性较高,敏感性低,标记抗体只能用于检测一种抗原。后者敏感性较强,一种标记抗体可用于多种抗原的检测。缺点是特异性较差。

免疫电镜技术的操作程序

抗体的制备,标本的处理,免疫标记,对照实验、结果的观察和解析。

抗体的制备

特异性高、亲和力强的高效价抗体是获得理想的免疫标记结果的首要条件要。抗体可购买或自己制备。大分子完全抗原,可直接免疫动物如家兔、山羊、豚鼠、小鼠来获得抗体。半抗原,用偶联剂使半抗原与大分子物质结合成复合物,再去免疫动物产生抗体,大分子物质称为载体蛋白,以甲状腺球蛋白、牛血清白蛋白或血蓝蛋白最为常用。偶联剂为戊二醛或碳二酰亚胺等。目前细胞杂交瘤技术制备的单克隆抗体最为理想。

标本的处理

为了既能将抗原准确定位甚至定量,又能观察到近似于生活状态下的细胞超微结构,必须选择合适的固定剂,慎重处理样品。

取材

单细胞:培养细胞或血细胞应随用随取。悬浮培养细胞可先离心(800 rpm,5 min),用磷酸缓冲盐溶液(PBS)洗1次后进行固定。贴壁细胞则可先将其培养在玻片上,用PBS轻轻冲洗后立即固定,也可用胰酶将细胞消化下来,按悬浮培养细胞的制备方法制备。
组织:取组织块时做到越快越好,最好在没有停止血流前就取材。若观察的对象为肺、大脑、脊髓或内分泌器官等比较柔软的组织,应先做灌注固定,再用锐利的刀片将其切成约2 mm×2 mm×l mm大小的组织块,切时要避免挤压与牵拉,然后投入到固定液中继续固定。

固定

固定剂常会对抗原的活性产生不同程度影响,为了保存细胞的超微结构和抗原的活性,应通过预试验,确定固定剂的种类、浓度、温度、pH及固定时间和方式,可用已知效价的抗原进行试验,选择合适的固定方法。

常用的免疫电镜标本固定液

多聚甲醛-戊二醛固定液(简称PG):1%多聚甲醛对组织细胞的抗原性影响不大,若加入超过0.1%戊二醛,抗原性就会迅速减弱;当戊二醛的浓度低到0.01%~0.05%时,对抗原性的影响便不显著,而细胞超微结构的保存也可获得很大改善。所以推荐用1%多聚甲醛加0.01%~0.05%戊二醛作为免疫电镜标本的固定剂,固定时间为4~5 h。对有些抗原性较强的标本,也可采用4%多聚甲醛加0.05%~0.5%戊二醛进行固定。某些抗原对戊二醛极其敏感,固定液只能用2~4%多聚甲醛,而不能加戊二醛。不充分的固定会造成抗原提取或移位,同时醛类等交联固定剂会改变蛋白质分子的结构而影响其抗原性,所以在不明显影响抗原性的前提下,选择合适的固定浓度和时间,尽可能强一些为好。
过碘酸盐-赖氨酸-多聚甲醛混合固定液(简称PLP):PLP液含0.01 mol/L过碘酸钠、0.075mol/L赖氨酸、2%多聚甲醛及0.037mol/L磷酸缓冲液。其机制是借助过碘酸盐氧化抗原,一般为糖蛋白的糖类部分,使其羟基变为醛基,这样赖氨酸的双价氨基就能与醛基结合从而把抗原交联起来。由于大多数组织抗原含蛋白质与糖类,抗原决定簇位于蛋白部分,该固定剂有选择性地固定糖类,这样既稳定了抗原,又不影响抗原决定簇与抗体的结合。加入低浓度的多聚甲醛则能稳定蛋白与脂类。因为赖氨酸价格较贵,此固定液不如PG固定液经济。
苦味酸-多聚甲醛-戊二醛固定液(简称PAPG):PAPG液含4%多聚甲醛、15%(V/V)苦味酸、0.5%戊二醛、pH为7.3。苦味酸穿透迅速,可在不影响抗原活性的前提下固定蛋白质,改善对膜和胞质的保存。特别是不能采用高浓度的戊二醛与锇酸做后固定时(如包埋后的免疫标记),在前固定液中加入苦味酸对超微结构的保存有很大帮助。

固定方法与时间

灌注固定:这是固定效果最好的方式,能使超微结构得到很好的保存。以大鼠为例,麻醉后,用注射针头经左心室向主动脉灌注固定液,静脉压为120mm Hg柱,在5~15 min内每200g体重灌注150 ml固定液。
浸没固定:将手术或灌注后切成的标本块浸没在固定液中固定,浸没固定时间常为2~5h,游离细胞固定0.5~1h。

包埋

包埋剂类型:环氧树脂包埋剂和低温包埋剂。
包埋前免疫标记:即对已固定的样品先进行免疫标记,然后进行包埋、超薄切片并观察结果,一般选用环氧树脂包埋剂。环氧树脂本质是疏水性的,在包埋前样品必须先进行完全脱水,然后在温箱中进行热聚合。热聚合会使大多数抗原变性,因此该包埋剂不适用于包埋后免疫标记。
包埋后免疫标记:指组织标本经固定及树脂包埋,制作成超薄切片后再进行免疫化学标记的方法,此方法多用低温包埋剂,如Lowicryl系列包埋剂、LR White包埋剂和LRGold包埋剂。这三种包埋剂均能在低温下(-35℃~-80℃)用紫外光(波长315~360nm)进行聚合,避免了高温对抗原性的负面影响,提高了阳性标记率,而且对胶体金的非特异性吸附少,对温度敏感的抗原应选择使用低温包埋剂。

免疫标记

根据免疫标记与标本包埋之间的不同关系,可分为包埋前免疫标记、包埋后免疫标记和不用包埋的冷冻超薄切片免疫标记。根据具体的标本、抗原的部位及性质并结合实验室的具体条件选择恰当的方法。这三种免疫标记方法,都包括非特异性位点的封闭、抗体与抗原特异性结合的免疫反应、反应部位的示踪显示等基本步骤。

包埋前免疫标记

优点一是切片在免疫标记前不经锇酸固定、脱水、树脂包埋及高温聚合的过程,抗原活性不会受到上述过程的影响,而且抗原暴露充分,标记的阳性率高,非特异性反应少。二是免疫标记后还可进行半薄切片,在免疫反应阳性部位做定位超薄切片,进一步提高电镜的检出率。三是免疫标记完毕后,用戊二醛与锇酸再次固定组织,可使抗原抗体的结合更加牢固,并有利于膜结构的保存。
包埋前免疫标记主要用于细胞膜表面抗原的免疫定位,以及用于某些易被脱水剂和树脂成分溶解和变性的抗原的检测。包埋前免疫标记细胞内抗原受到标记抗体的穿透性限制,为了提高对细胞内抗原的标记率可以采取以下措施:

厚切片

厚切片进行包埋前免疫标记,需将固定后的组织厚切片(单细胞团不需厚切片),以利于标记抗体的穿透。厚切片的方法有以下几种:
冰冻切片:用恒冷箱冰冻切片机将固定后的组织块切成8μm左右的厚片。将切下的厚片放入盛有PBS的小玻璃瓶内备用。也有的将厚片直接贴在载玻片上进行免疫标记,这样做虽然操作比较方便,但因抗体只能与厚片的一面接触,所以会在一定程度上影响标记的阳性率。
震动切片:震动切片可以切出20μm~30μm的厚片,免疫电镜用只需20μm~80μm的切片。震动切片的优点是可以避免冰冻对组织带来的损害,但它切出来的切片过厚,即使在使用穿透剂的条件下,免疫试剂也仅能穿透切片表面8μm~9μm,而更深层的组织就不易被标记。

增加细胞膜的通透性

用0.01%Saponin或0.1%Triton X-100等活性剂处理5~8min,以增加细胞膜的通透性。但这些化学物质会对超微结构产生一定程度的破坏,所以应根据不同的组织或细胞,严格控制活性剂的应用浓度与时间。也可用冻融的方法增加细胞膜通透性,标本先进行防冰晶处理(厚片在含15%甘油、20%蔗糖的PBS中振摇沉底),在液氮中速冻0.5~1min后用PBS迅速回温。

选用相对分子质量较小的标记物

辣根过氧化物酶与IgG的Fab片段交联物,分子质量较小,约100kD,较易进入细胞内。也可用IgG Fab-lnm金作为标记物,标记后经银加强染色的纳金包埋前标记法。由于该标记物较易穿透到组织和细胞内,且定位比酶标抗体精确,因此被广泛用于膜受体的精确定位。

包埋后免疫标记

包埋后免疫标记具有超微结构保存较好、方法简便可靠、阳性结果重复性高的优点,可对同一组织块的连续切片做各种对照免疫标记,能十分准确地解释免疫标记结果,而且还能在同一张切片上进行多重免疫标记,尤其适合于颗粒性标记物(胶体金标记)的免疫化学定位标记,是目前应用最广的免疫电镜技术。但是该方法也有明显的缺点,抗原在脱水、浸透及树脂包埋过程中可能被破坏,且抗原被树脂遮盖不易与抗体接触,使免疫标记的阳性率下降。尤其是后固定剂锇酸对抗原的破坏较严重,因此常常避免使用。为了得到精细的超微结构并提高阳性标记率,必须注意以下几个方面:
通过预实验确定合适的固定液,在保存抗原活性的前提下,也能得到较好的超微结构。固定液一般不用四氧化锇,因其会使抗原活性明显降低。

选用低温包埋剂。

免疫电镜用载网要选用镍网或金网,而不用铜网,因铜网会与某些化学物质产生反应而影响标记结果。

冷冻超薄切片免疫标记

冷冻超薄切片免疫电镜技术的特点是组织不经脱水包埋直接冷冻,在冷冻状态下进行超薄切片,然后进行免疫标记。该项技术克服了上述两种方法的缺点,能更理想地保存一些生物大分子的活性,极大地提高了免疫标记的敏感性,但在冷冻过程中超微结构会受到冰晶的破坏。1996年,LiouW等改良了冷冻超薄切片技术,用甲基纤维素和醋酸铀混合液(含1.5%~2%甲基纤维素,0.3%~3%醋酸铀的水溶液)代替传统的蔗糖溶液作为将冷冻切片从冷冻槽中转移到镍网上的溶液,得到了保存良好的超微结构,使该项技术更加完美,应用也越来越广泛。但该项技术必须有特殊的冷冻超薄切片机,且技术难度较高。

对照实验

为了证实免疫标记结果的特异性,必须同时进行对照实验。在抗体的特异性无问题的前提下,对照实验有以下几种:
用未经免疫的同种动物正常血清代替第一抗体,结果应为阴性。 不加一抗,结果应为阴性。 用不含有靶抗原的标本进行免疫标记,结果应为阴性。 对肯定含有靶抗原的标本进行免疫标记,结果应为阳性。

结果的观察和解析

在电镜下观察免疫标记的结果,通过标记物(胶体金、铁蛋白或酶底物)显示免疫反应部位以定位抗原的存在位置,注意区分特异性标记和背景的非特异性标记,进行正确的结果分析
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- 来自原声例句
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