制备待测DNA样品
将新鲜组织研磨成匀浆收集细胞或培养好的细胞用胰酶处理后收集,先反复用酚处理细胞两次后,加入氯仿抽提蛋白质。用乙酸铵和无水乙醇沉淀DNA,并用70%乙醇洗涤一次,加入TE缓冲液溶解。在用琼脂糖凝胶电泳确认基因组DNA成功提取后,加入限制性内切酶消化,过夜反应。
琼脂糖凝胶电泳
制备0.8%-1.0%的凝胶,用0.5*TBE作电泳缓冲液,根据胶的长度,在1V/cm的电压下电泳,至上样缓冲液(如溴酚蓝等)到达特定位置停止。
DNA变性
DNA受酸、碱、热等处理均能发生变性,但强酸会使核酸降解。一般认为碱变性较好,可避免DNA降解。将凝胶在脱嘌呤液中浸泡20min(视靶序列是否大于5kb,若大于则需要此步骤),室温轻轻晃动至溴酚蓝从蓝变黄。洗涤一次后在变性液中浸泡30min,再在0.5*变性液中浸泡20min,即可进行Southern转印。
Southern转印
这里介绍两种常用的转印方法:毛细转印和电转印法。
[编辑]毛细转印法 早期Southern blot是使用毛细转印法,经虹吸作用,转移到NC(硝酸纤维)膜上。
在搪瓷盘中加入300ml 10×SSC,放上培养皿和小玻璃板;将3张长滤纸浸湿,逐张放在玻璃板上,用移液管的滚动,赶走气泡;切除多余凝胶,小心地将凝胶放在滤纸上,赶走滤纸与胶之间的气泡;再将与胶大小相同的尼龙膜放在胶上,同样不能有气泡,然后放上三张浸湿的滤纸,赶走气泡;紧贴凝胶四周各放一张X光片;小心蒙上一张比搪瓷盘大的保鲜膜。保鲜膜要紧贴滤纸,但不能让滤纸移动;用刀片在离滤纸周围约1-2 mm处,轻轻割断保鲜膜,但不能割破滤纸。取走滤纸上的保鲜膜;整齐地放上草纸,数张草纸一折二,草纸堆要高出搪瓷盘边约10cm;在草纸上放上玻璃板, 压上约500g重的重物, 转移过夜。[编辑]电转印 转印法经过改良后,快速简便的电转印法如今应用的更加普遍。
将胶平放于干净投影胶片上;裁剪一张与胶同大小的尼龙膜或NC膜,用0.5*TBE浸湿后小心平铺在胶表面,用玻璃棒出去凝胶和膜之间的气泡;裁剪6张同样尺寸的滤纸,用0.5*TBE浸湿后平铺于膜上,用玻璃棒去除气泡;在胶的另一面同样铺上6层0.5*TBE浸湿的滤纸,除气泡;将“滤纸-尼龙膜(NC膜)-凝胶-滤纸”转印装置移入电转印仪中,使膜面向阳极,凝胶面向阴极,室温下,100mA转印60min。
膜的固定
取出膜在2*SSC中浸泡20min。将膜DNA面朝上置于滤纸上,再覆盖一张滤纸,60℃烤膜30min。
杂交和洗膜
将膜放入杂交管内, 加预杂交液, 60℃封闭4-6小时。倒出预杂交液,加杂交液,60℃杂交过夜。再将膜放在洗膜溶液I(2*SSC、0.1%SDS)中,室温洗2次,每次摇动10min。再在洗膜溶液II(0.5*SSC、0.1%SDS)中漂洗2次, 每次摇动20min。
检测
将膜在洗膜缓冲液中漂洗3分钟;在封闭缓冲液中室温摇动封闭30分钟;在抗体溶液中室温摇动,孵育30分钟;用洗膜溶液III洗2次, 每次15分钟;将膜与新鲜配制的显色溶液一起在黑暗中温育0.5-16小时;当条带显色到合适的深度后, 或在膜背景变深前, 用TE洗去底物液,干燥保存。