虽然有一些学说认为翼手目的两个亚目有不同的进化线路(大蝙蝠亚目与灵长目亲缘非常近,小蝙蝠亚目与食虫目亲缘近)。但以目前从DNA的分析认为,蝙蝠的两个亚目是从同一个来源所演化而来。甚至发现,有些小翼手目的蝙蝠的血缘更亲近于某些大翼手目的蝙蝠。 并且相信两个亚目都是从会飞行的祖先演化而来。
翼手目的动物在四肢和尾之间覆盖着薄而坚韧的翼膜可以像鸟一样鼓翼飞行,这一点是其他任何哺乳动物所不具备的,为了适应飞行生活,翼手目动物进化出了一些其他类群所不具备的特征,这些特征包括特化伸长的指骨和连接其间的皮质翼膜,前肢拇指和后肢各趾均具爪可以抓握,发达的胸骨进化出了类似鸟类的龙骨突,以利胸肌着生,发达的听力等。