几乎所有双子叶植物都容易受到土壤农杆菌感染,而产生根瘤。它是一种
革兰氏阴性菌(A. tumefaciens)。其致瘤特性是由Ti(tumor-inducing)
质粒介导的。农杆根瘤菌之所以会感染植物根部是因为植物根部损伤部位分泌出
酚类物质
乙酰丁香酮和羟基乙酰丁香酮,这些酚类物质可以诱导Vir(Virulence region)
基因的启动表达,Vir基因的产物将Ti质粒上的一段T-DNA 单链切下,而位于根瘤染色体上的操纵子
基因产物则与单链T-DNA 结合,形成复合物,转化植物根部细胞。T-DNA 上有三套基因,其中两套基因分别控制合成植物生长素与分裂素,促使植物创伤组织无限制地生长与分裂,形成冠瘿瘤。第三套
基因合成冠瘿碱,冠瘿碱有四种类型:
章鱼碱(octopine)、
胭脂碱(nopaline)、农杆碱(agropine)、琥珀碱(succinamopine),是农杆菌生长必需的物质。
Ti质粒的结构
在发现根瘤农杆菌诱发
冠瘿瘤的本质是Ti质粒后,Ti质粒便成为冠瘿瘤形成
基因鉴定与分析的主要研究对象。
Ti质粒大约在160~240kB之间。其中T-DNA 大约在15kb-30kb。Vir
基因区在36kb左右。除此之外,Ti质粒上还存在Con区(region encoding conjugation)和Ori区(origin of replication)。c. Ti质粒约为200kb,重组操作非常苦难,也很难找到单一的
酶切位点。d. Ti质粒不能在大肠杆菌中复制,为了使
重组质粒DNA 的大量扩增,须添加入大肠杆菌复制子。 加入植物细胞的筛选标记,如neor基因,使用植物细胞启动子及末端polyA化信号,加入多聚人工接头以利于
外源基因的。
植物中一般不存在质粒,为利用农杆菌的Ti质粒,发展了共整合系统和双元载体系统,避免了在大的Ti质粒上进行分子重组操作的困难。
植物细胞转化的共整合系统
T-DNA 在大肠杆菌质粒上,含有E.coli的选择标记和植物选择标记Kmr。首先在E.coli中筛选重组分子,然后将
重组质粒转化到农杆菌中,质粒与Ti质粒上的同源序列发生
同源重组,将
外源基因整合到Ti质粒上,用于侵染植物细胞。T-DNA 重组分子整合到植物细胞染色体DNA 上,Kmr筛选
转化细胞。
. 植物细胞转化的双元系统
目前T-DNA 转化植物细胞的标准方法是双元系统,即
穿梭质粒。插入
外源基因的重组
穿梭质粒直接转化含有Ti质粒的根瘤农杆菌,经筛选后直接感染植物细胞。与共整合系统所不同的是,含
外源基因的质粒可在农杆菌内自主复制并保留下来。农杆菌侵染植物细胞后,植物的创伤信号启动Ti质粒上的Vir
基因,随后将
穿梭质粒的T-DNA 切割下来,转移到植物细胞中。
T-DNA 上共有三套
基因和左右两个边界,LB和RB是长为25bp的末端反复重复顺序,在切除及整合过程具有重要意义。
tms由两个组成:tms1(iaaM)和tms2(iaaH)
tmr由一个组成iptz:
tmt由若干
基因构成,合成稀有
氨基酸衍生物,称为opines。它有三个成员:octopine=精氨酸与丙酮酸的缩合物 ,Napaline=精氨酸与-酮戊二酸的缩合物,Agropine=谷氨酸与二环糖的缩合物。
据此可将Ti质粒分为三大类,感染的植物诱导合成这些
有机碱,但不能利用它们,其分解酶基因在Ti质粒上,分解产物为氨基酸和糖类,供根癌农杆菌使用作为氮源及碳源。
2.T-DNA 的整合机制:T-DNA 的详细整合机制尚不清楚,但有几个环节是明确的:
T-DNA 切除由Vir区编码的特异性内切酶完成,分别在LB和RB的第三个
碱基和第四个碱基之间产生缺口,并形成单链T-DNA 。
T-DNA 的LB和RB在整合中的作用是不对称的,RB顺序与整合有关,而LB无关。
T-DNA 的整合可以是单拷贝的,也可以是多拷贝的,成串联形式排列,但整合位点的特异性尚未确定。