由于梨火疫病在世界各国均很重视,研究亦相对较多,其检验方法亦很多,从经典的分离培养、致病性测定、症状观察等到先进的分子生物学技术,包括DNA探针、PCR技术的应用及脂肪酸分析、单克隆抗体的应用等等,但在目前检疫上仍采用免疫荧光染色结合致病性测定确诊的方法。
症状观察 梨火疫病的症状很典型,是鉴定的重要方法,但必须与其他症状相似的梨梢枯病区分开。主要区别见(Zwet和Keill1979)
分离培养 对于症状明显材料可直接分离病原,而症状不明显的材料如水果、幼枝等,可先进行IF(免疫荧光法)检测,再进行分离。分离可采用选择性培养基和鉴别性培养基进行。
MS培养基 这是Miller和Schroth专为梨火疫病菌设计的选择性培养基。梨火疫病菌菌落为红橙色,背景为兰绿色。配方如下:琼脂20g,甘露醇10g, L-天门冬酰胺3g,牛胆酸钠2.5g,磷酸氢二钾2.0g,烟酸0.5g,MgSO4·7H2O0.2g,次氮基三乙酸0.2g,硫酸十七烷基钠0.1ml,0.5%溴麝香草酚兰水溶液9ml,0.5%中性红2.5ml,蒸馏水970ml,pH7.3灭菌后加1%放线菌酮5ml,1%硝酸铯水溶液1.75ml。
CG培养基 这是Cross和Googman设计的高糖培养基,梨火疫病菌在28℃培养60小时后形成典型的火山口状菌落,特别是在立体显微镜下。配方如下:水380ml,蔗糖160g,营养琼脂12g,结晶紫0.8ml(1%乙醇溶液),0.1%放线菌酮20ml。
TTC培养基 该培养基是Weise(1981)设计的四氮锉-福美联培养基。梨火疫病菌在27℃培养2~3天后,可产生红色肉疣状菌落。配方如下:营养琼脂37g,蔗糖100g,酵母粉5g,葡萄糖15g,水100ml,pH6.8~7.2。灭菌后加0.5%TTC10ml,福美联85~250ml。
CCT半选择性培养基 这是Tshimaru和Kios于1984设计的。梨火疫病菌 28℃培养48小时后,形成淡紫色透明菌落,中央颜色略深,配方如下:蔗糖10g;山梨醇10g;1%SDS30ml,0.1%结晶紫乙醇溶液2ml,营养琼脂23g,蒸馏水 970ml。灭菌后加入1%硝酸铯水溶液2ml和放线菌酮0.05g。
Zeller改良高糖培养基 梨火疫病菌在此培养基上27℃培养2~3天后,菌落大小为3~7mm,橙红色半球形,高度凸起,中心色深,有蛋黄状中心环,表面光滑,边缘整齐。配方如下:牛肉浸膏8g,蔗糖50g,放线菌酮50mg,0.5%溴百里酚兰9ml,0.5%中性红2.5ml,琼脂20g,水1000ml,pH7.4。
另外,梨火疫病菌在NA+5%蔗糖等培养基上,典型菌落果聚糖阳性,在紫外灯下无荧光。
免疫荧光染色(IF) 对于呈现梨火疫病症状的材料,可直接平板分离,后免疫学试验即可确诊。对于表面健康的材料,可能携带潜伏或附生的梨火疫病菌,可先用IF法筛选,若阳性,再分离和其他生理生化试验、致病性试验确诊。
取样和抽提 随机选取100株不同种或品种植株上约10cm长的100根枝条为一样品。每个样品随机抽取30根枝条,其余5℃保存备用。每根枝条切成4段(共120小段)。室温下将上述小段放于烧瓶,加0.01MpH7.2PBS吐温溶液浸泡,并振荡1.5小时。上清液经烧结玻璃滤器(Whatman1号滤纸)过滤后,在10000g离心20分钟,沉淀用1ml灭菌的PBS悬浮,其中0.6ml悬浮液加一滴 Difco甘油于-20℃保存备用。
间接免疫荧光抗体染色(IFAS) 采用抗梨火疫病菌的抗血清,设同源抗原对照及阴性对照、正常血清对照和空白对照。在12孔载玻片上,每孔加20ml试验悬浮液,及对照孔PBS。阳性菌等,火焰热固定后,各加2?l一定稀释度的抗血清,37℃保湿孵育30分钟,用0.01MPBS轻轻换洗3次。洗干后每孔加20?l1:10稀释的FITC标记的Ig,37℃保湿孵育30分钟,同上洗、干后,每孔加1滴 0.1MpH7.6的磷酸甘油封片,并在有上荧光光源和适宜滤光片的荧光显微镜下检查。观察形态典型的荧光细胞若IF阳性,再进行分离病原及有关试验。
玻片凝集试验 典型形成果聚糖,无荧光的菌落在载玻片上与1滴1:20稀释(0.01MPBS)抗梨火疫病菌的抗血清进行玻片凝集试验。
生理生化试验 在某些特定情况下,对形成果聚糖,凝集试验阳性,无荧光菌落进行生理生化鉴定及有关鉴定是必要的。最简单的途径是用IF和API-20快速生化鉴定板。
致病性实验 梨火疫病菌致病性试验可用梨片或梨嫩枝测定,亦可用烟草过敏反映检查。NA上培养48小时的细菌配成108cells/ml的悬液,注入烟草叶片或接种于1cm厚梨片、或针刺接种于1丈长的巴黎枝条,28℃下培养,一般10~12小时后,烟草注射区出现白色坏死斑。1~3天后,梨片或枝条上出现白色菌脓,则可确诊。
其他鉴定方法 梨火疫病的检测鉴定技术发展较快,其中目前应用较多有脂肪酸分析,该方法在美国、英国用于鉴定菌种,并建立了相应的数据库(Zwet)。另外,DNA探针、PCR技术亦用于梨火疫病菌的检测和鉴定,特别是美国、新西兰、德国、加拿大等均已开始应用于实际检疫,特别是新西兰利用DNA探针检测水果的带菌情况。