利用反向PCR可对未知序列扩增后进行分析,探索邻接已知DNA片段的序列,并可将仅知部分序列的全长cDNA进行
分子克隆,建立全长的DNA探针。适用于
基因游走、
转位因子和已知序列DNA旁侧病毒整合位点分析等研究。
用传统的
缓冲液和其他提供者推荐的条件裂解DNA。反向PCR所扩增的片段的大小由 PCR扩增片段的大小决定,目前,PCR扩增的实际上限为3-4kb。在许多情况下,首先 需要进行Southern杂交来确定
内切酶用以产生大小适于环化及反向PCR的片段的末端 片段。能裂解核心区的
内切酶使反向PCR只能扩增
引物所定模板(依赖于引物)的上游 或上游区,而不裂解核心区的酶则使两上边侧序列都扩增,并带有由内切酶和环化类 型决定的接点(例如,互补突头连接与钝头连接)。对于扩增左翼或右翼序列,初试时 最好靠近识别上个
碱基位位的酶,并已知在核心区有其方便的裂解位点。如果用反向 PCR从含有大量不同的克隆片段的同一载体中探测
杂交探针,建议事先在载体中引入 合适的
酶切位点。
用T4
连接酶在稀DNA浓度下
环化更容易形成单环。在一些实验中,为产生对反向 PCR大小适当的DNA片段需要两种内切酶,但这样所产生的片段末端则不适于连接,环 化前需用Klenow或
噬菌体T4DNA
聚合酶修理(
钝化)。连接前,需用酚或
热变性使内切 酶失活。
聚合酶链反应条件与经典所用的相同,例如,94℃-30秒变性,58℃-30秒
引物退火, Taq聚合酶70℃延伸3分钟,进行30个循环。可改变PCR条件以生产特异产物。将反向 PCR用于测序时,与核心区末端后部结合的扩增
引物更为有用,它使测序引物扩增部 分的核心序列与未知边侧序列间的接点更近,减少了扩增引物的干扰。