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Ames试验全称污染物致突变性检测。

基本介绍

Ames试验全称污染物致突变性检测。
污染物对人体的潜在危害,引起人们的普遍关注。世界上已发展了百余种短期快速测试法,检测污染物的遗传毒性效应。B.N.Ames等经十余年努力,于1975年建立并不断发展完善的沙门氏菌回复突变试验(亦称Ames试验)已被世界各国广为采用。该法比较快速、简便、敏感、经济,且适用于测试混合物,反映多种污染物的综合效应。众多学者有的用Ames试验检测食品添加剂、化妆品等的致突变性,由此推测其致癌性;有的用Ames试验检测水源水和饮用水的致突变性(比如,美国派斯净水器就通过了Ames试验),探索较现行方法更加卫生安全的消毒措施;或检测城市污水和工业废水的致突变性,结合化学分析,追踪污染源,为研究防治对策提供依据;有的检测土壤、污泥、工业废渣堆肥、废物灰烬的致突变性,以防止维系生命的土壤受致突变物污染后,通过农作物危害人类;检测气态污染物的致突变性,防止污染物经由大气,通过呼吸对人体发生潜在危害;用Ames试验研究化合物结构与致变性的关系,为合成对环境无潜在危害的新化合物提供理论依据;检测农药微生物降解前后的致突变性,了解农药在施用后代谢过程中对人类有无隐患;还有用Ames试验筛选抗突变物,研究开发新的抗癌药等等。

目的和原理

鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)的组氨酸营养缺陷型(his-)菌株,在含微量组氨酸的培养基中,除极少数自发回复突变的细胞外,一般只能分裂几次,形成在显微镜下才能见到的微菌落。受诱变剂作用后,大量细胞发生回复突变,自行合成组氨酸,发育成肉眼可见的菌落。某些化学物质需经代谢活化才有致变作用,在测试系统中加入哺乳动物微粒体酶,可弥补体外试验缺乏代谢活化系统之不足。鉴于化学物质的致突变作用与致癌作用之间密切相关,故此法现广泛应用于致癌物的筛选。
实验用菌株的细胞壁还有能使实验物易于渗透的突变。为了进一步增加试验的敏感性,这些菌株的切除修复DNA的能力是缺陷的,并且还有提高错误倾向的DNA修复的质粒基因。

步骤和方法

Ames试验的常规方法有斑点试验和平板掺入试验。
1.菌株鉴定 用于测试的菌株,需经基因型和生物学性状鉴定,符合要求才能投入使用。
目前推荐使用的一套菌株是TA97、TA98、TA100和TA102。鉴定前先进行增菌培养。为鉴定结果可靠,需同时培养野生型TV菌株,作为测试菌基因型之对照。增菌培养用牛肉膏蛋白胨液体培养基,接种后于37℃,100r/min振荡培养12h左右,细菌生长相为对数期末,含菌数应为1×109个/ml~2×109个/ml。
鉴定项目:
(1)脂多糖屏障丢失(rfa)用接种环或一端挠起的接种针以无菌操作术取各菌株的增菌培养液,在营养琼脂平板上分别划平行线,然后用灭菌尖头镊夹取灭菌滤纸条,浸湿结晶紫溶液,贴放在平板上与各接种平行线垂直相交。盖好皿盖后倒置于37t温箱,培养24h后观察结果。
(2)R因子 划线接种,贴放滤纸条及培养等均同上,唯滤纸条浸湿的药液不同,为氨苄青霉素钠溶液。TA102除pKM101外,还有pAQ1,载有抗四环素的基因,故另用滤纸条浸湿四环素溶液后贴放于划线接种的平板上。
(3)紫外线损伤修复缺陷(△uvrB)在营养琼脂平板上按上述方法划线接种后,一半接种线用黑玻璃遮盖,另一半暴露于紫外光下8sec,然后盖好皿盖并用黑纸包裹平皿,防止可见光修复作用。培养同上。
(4)自发回变 预先制备底平板;向灭菌并在水浴内保温45℃的上层软琼脂中注入0.1ml菌液;混匀后倾于底平板上并铺平。平皿倒置于37℃温箱培养48h。
(5)回变特性——诊断性试验 上层软琼脂中除菌液外,还注入已知阳性物之溶液,需活化系统者并加入S9mix,余同上。
组氨酸营养缺陷型由自发回变即可知。
2.斑点试验吸取测试菌增菌培养后的菌液0.1ml,注入融化并保温45℃左右的上层软琼脂中,需S9活化的再加0.3ml-0.4mlS9mix,立即混匀,倾于底平板上,铺平冷凝。用灭菌尖头镊夹灭菌圆滤纸片边缘,纸片浸湿受试物溶液,或直接取固态受试物,贴放于上层培养基的表面。同时做溶剂对照和阳性对照,分别贴放于平板上相应位置。平皿倒置于37℃温箱培养48h。在纸片外围长出密集菌落圈,为阳性;菌落散布,密度与自发回变相似,为阴性。
3.平板掺入试验 将一定量样液和0.1ml测试菌液均加入上层软琼脂中,需代谢活化的再加0.3ml-0.4ml S9mix,混匀后迅速倾于底平板上铺平冷凝。同时做阴性和阳性对照,每种处理做3个平行。试样通常设4个~5个剂量。选择剂量范围开始应大些,有阳性或可疑阳性结果时,再在较窄的剂量范围内确定剂量反应关系。培养同上。同一剂量各皿回变菌落均数与各阴性对照皿自发回变菌落均数之比,为致变比(MR)。MR值≥2,且有剂量-反应关系,背景正常,则判为致突变阳性。
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- 来自原声例句
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