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补体(complement,C)是存在于正常人和动物血清与组织液中的一组经活化后具有酶活性的蛋白质。早在19世纪末Bordet即证实,新鲜血液中含有一种不耐热的成分,可辅助和补充特异性抗体,介导免疫溶菌、溶血作用,故称为补体。补体是由30余种可溶性蛋白、膜结合性蛋白和补体受体组成的多分子系统,故称为补体系统(complement system)。根据补体系统各成分的生物学功能,可将其分为补体固有成分、补体调控成分和补体受体(CR)。

结构

补体的分子生物学进展迅猛,对补体系统的活化机理和功能得到了分子水平的解释。各种补体分子的cDNA
补体成分

补体成分

已克隆成功,绝大多数补体蛋白的基因在染色体上的定位已被确定,并通过对它们的核苷酸序列和氨基酸序列的分析,发现许多补体蛋白的基因在染色体上相连锁,在结构上具有共同性。 补体蛋白结构的共同性
通过对补体系统的蛋白结构进一步探查,表现了一些颇具特色的结构功能域(module),并根据它们在氨基酸序列上的同源性,将它们归为几个不同的蛋白家族。同一家族中的各个成员通常具有相类似的结构和功能。此外,根据不同补体蛋白基因间的同源性,提示每个家族的成员可能是由一个共同的祖基因复制而来,出现结构上的多样性,进而使各种补体蛋白又具有各自特定的功能。

C1q与其相关的分子

C1q与其相关的分子:甘露糖结合蛋白(mannose-bindingprotein,MBP)、肺表面活性物质脱辅基蛋白A和D(surfactant protein A and D,SP-A,SP-D)、类风湿因子(RF)和胶固素(conglutinin)等,为具有以胶原样蛋白和凝集素区结构为特征的一组蛋白。因此有人将collagen与lectin两字缩合,归纳称为“collectin”(可暂译为胶凝素)。这些相关分子均能以抗体依赖或非依赖的方式被激活,再激活补体系统,或具有结合C1q-R的能力,从而模拟和放大C1q的功能作用。

丝氨酸蛋白酶补体分子

在补体固有成分和调节蛋白中,共有6个丝氨酸蛋白酶(原)。即:C1r、Cls、C2、B因子(Bf)、D因子和I因子。它们除彼此在氨基酸序列上有同源性外,还与非补体性丝氨酸蛋白酶(如胰蛋白酶和糜蛋白酶)高度同源。但C2和Bf的催化部位比常见的丝氨酸蛋白酶约多210个氨基酸残基。在6个补体性丝氨酸蛋白酶中,C1r和C1s,C2和Bf又具有更大的相似性。
C1r和C1s均为单链长形结构,两端呈球形似哑铃状,分子量均为85kDa。二者除在C端有共同的丝氨酸蛋白酶结构功能域外,其N端有约450个氨基酸彼此同源。均含有2个拷贝的SCR和1个拷贝的EGF前体结构功能域。
C2和Bf均为单肽链糖蛋白,它们除在形成两条补体激活途径中和C3转化酶方面十分相似外,在合成部位、合成途径、分子大小、亚单位结构、半胱氨酸位置及数目,以及保守残基替代及活性部位等方面也有很大的相似性。C2和Bf分子中相同的结构功能域是均有3个CSR、1个与vonWillebrand因子(vWF)共同的氨基酸序列和1个丝氨酸蛋白酶结构功能域。

末端补体分子

末端补体分子C6,C7,C8和C9是构成膜攻击复合体(MAC)引起靶细胞溶解破坏的重要组成成分。功能
激活补体

激活补体

上的相似性反映了它们结构上的共同性。均具有420kDa的I型凝血敏感蛋白重复序列(thrombospondin type I repeat,TSP-1),而且与TSP-1特有的β片层、和β螺旋结构的立体配体也是类似的。此种结构单位也存在于备解素(properdin)和疟原虫的羧箕末端。除TSP-1外,它们还具有1个拷贝的低密度脂蛋白受体结构功能域(low density lipoprotein receptor module,LDL-R),1个表皮生长因子前体结构功能域(EGf precusor module)。在肽链的中央还有1个半胱酸贫乏区与细胞毒性细胞和NK细胞释放的perforin的结构具有相似性(图5-19)。其中C6和C7具有更大的同源性。二者除上述的结构功能域外,在C端还存在着富含半胱氨酸的重复序列,即为2个CSR和2个与I因子重链中有一个区具有同源性的结构功能域(factor I module,FIM)。二者的分子量也相近似,分别为128kDa和121kDa。显著的差别仅仅是C6的N端多1个由59个氨基酸组成的TSP-1。

具有SCR的6种补体调节蛋白

补体活化调节蛋白(requlator of complement activation,RCA)包括:CR1、CR2、H因子、C4bp、DAF和MCP。它们共同的结构特征是均具有多个类似的短同源重复序列(SCR)。SCR也称Shushi单位。一个SCR约由60-70个氨基酸残基所组成,大小为4.5nm。SCR之间有20-40%的同源性。所有的SCR均具有固定的保守骨架序列(其中有4个半胱氨酸形成两个二硫键),并与脯氨酸、色氨酸、酪氨酸/丙氨酸、甘氨酸相维系而形成一独特的结构单位。这一结构单位在CR1中有32个,CR2中有15-16个,H因子中有20个,C4b中有12个,DAF和MCP中各有4个,而且是构成这些补体蛋白肽甸的主要结构。SCR在RCA中的功能是与C3、C4和C5结合,发挥其调节作用。在前述的C1r、Cls、C2、Bf、C6和C7中也含有几种非补体性蛋白如IL-2R、β2糖蛋白1(β2-1)、内皮细胞-白细胞粘附分子-1(ELAM-1)、淋巴细胞的归位受体和凝血因子Ⅻ的b亚单位中也含有SCR,但其意义不详。值得注意的是,牛痘病毒具有SCR的编码DNA,且与C4bp的SCR相类似,可逃避补体经典途径对其发挥作用。

特征

补体的遗传学特征学特征表现为多种补体分子具有遗传的多态性在染色体上密切连锁的,形成不同的基因家族。

补体的遗传多态性

补体的遗传多态性(genetic polymorphism)是指在同一集团中,两个或两个以上非连续性突变体或基因型(称型态),以极小的频率有规律地同时发生的现象。补体成分的多态性是Alpert和Propp1986年在人的C3中首次发现的。此后,已从基因型和表型水平获得有关不同种内补体缺陷与补体多态性的知识,并从四个水平研究了补体的多态性:①通过对血清中天然补体成分同种型的分析(表型水平);②通过确定它们的亚单位组成(亚表型水平);③通过建立群体遗传学和形式遗传学(即同种异型的频率和各个基因等位基因的频率与分离);④通过对它们DNA结构的定位和测序,提示限制性片段长度多态性
补体

补体

(restriction fragment lenght polymorphism,RFLP)。已发现许多补体分子具有多态性,其中以C2、Bf、C4、C3和C6最为显著。

定位于第1号染色体长臂32区的RCA基因簇

这一基因簇包括:CR1、CR2、H因子、C4bp、DAF和MCP的基因。由于这一紧密连锁的基因簇调控着补体系统的活性,因此可以得出下面的结论:基因的连锁是维持密切相关功能的进化的现象。变异体的罕见可能是进行选择的有利条件,或有时是一种致病的因子。

定位于第5号染色体上的MAC补体基因簇

确定在5号染色体的短臂存在着补本末端成分C6、C7和C9的基因簇,并发现C6和C7的基因通常是紧密连锁着的,证据主要来自一个C6/C7联合缺陷的病例。C6缺陷者与反复发作的脑膜炎奈瑟氏菌的感染有很强的相关性。某些C7缺陷的个体也易感染奈瑟氏菌。其余个体则是健康的。惊奇的是所有C9缺陷的个体(1便除外)似乎都健康。这些现象说明,在MAC补体分子中,包括定位于其他染色体的基因编码的C8在内,存在着某种程度的互补性。即一种补体分子的缺陷,可补其他末端补体分子的功能所补偿。C8的3个亚单位(α、β和γ)分别为第1号染色体上的C8A、CIB基因和定位于第9号染色体长臂的基因C8G的产物。

定位于第6号染色体短臂21.3区的MHCⅢ类基因

有许多证据表明,C2、C4和Bf由位于MHCI、Ⅲ类基因间一段长80kb的DNA所编码。C2和Bf基因的500kb之中有一部分相重合。C4由2个紧密连锁的位点上的基因C4A(22kb)和C4B(16kb)所编码。纯合性的Bf缺陷尚末见报道,但偶可见一纯合性C4和C2的缺陷。并常与SLE或SLE样疾病相关联。约有2/3纯合性C2缺陷的个体是健康的,说明C2的缺陷至少有一部分可被无缺陷的C4所补偿。C2和Bf均具有多态性。人的C2主要由三个等位基因(C2A、C2B和C2C)所编码。在补体成分的缺陷中,C2的遗传性缺陷所占比使例较高,为常染色体共显性遗传。C2缺陷者发生免疫复合物病及SLE的危险性较大。Bf的遗传多态性最常见的表型为S(slow)和F(fast),另外还发现近20种罕见型,基因频率均<0.02-0.03。B因子的多态性与某些自身免疫病和感染性疾病有关。C4A和C4B则具有复杂的多态性,已发现有30多个同种异型,分别有15和14个等位基因。由C4A和C4B基因编码的两种蛋白有99%的序列同源性,但二者在功能上却有明显的差别。两种同型的差别只是1个决定簇的不同。如将1101位的亮氨酸置换为脯氨酸,在SDS-PAGE上即可出现2kDa的表观分子量的改变;若将1106位的天冬氨酸置换为组氨酸,可使基溶血活性出现3-4倍的变化。另有2个位点含有所谓的Null基因称为:“零基因”(C4quantitativezero,C4QO)或静息基因,检不出基因产物的频率为10-20%,系由于基因的缺失、基因转换或不表达所致。C4A和C4B在功能上的送别表现为:①溶血活性不同,C4B明显高于C4A,因C4B与羟因形成酯键的速度大于C4A的10倍,而C4A与氨基形成酰胺键的速度大于C4B的100倍。②C4A在抑制免疫沉淀中的作用较C4B大1.7倍,对腮腺炎病毒的中和作用较C4B大10倍;③抗原性上也有差别;几乎所有C4A分子中都含Rodgers血型抗原,而C4B则含有ChidO血型抗原。C4A缺陷与多种疾病的关联,如SLE、RA、全身性硬化、亚急性硬化性全脑炎(SSPE)、慢性多发性关节炎、重症肌无力、内脏利什曼病、普通变异型肾小球肾炎、麻风、巴西芽生菌病、IgA缺陷、胰岛素依赖的糖尿病(IDDS)、恰加氏病(非洲锥虫病)和艾滋病
已对大多数补体分子的结构和遗传学特征进行了较深入地研究,发现许多补体分子遗传上的异常与某些疾病的关联。但将体外功能上的改变就视为与体内的某一现象有关尚为时过早。研究的重要任务,在于阐明补体相关疾病发病机理中的致病因子来取代统计学上的相关性。

固有成分

补体系统两条激活途径中,涉及到14个补体蛋白(C1-9,及B、D、P因子)的参与。 由于分子遗传学和分子克隆技术的应用,已阐明许多补体分子的结构、功能、生物合成及遗传特征,从而大促进了人们对补体系统激活过程机理的认识和对各个补体分子功能的深入了解。

C1分子

C1是经典激活途径中的起始成分。它是由1个分子的C1q和2个分子的C1r及2个分子的Cls借Ca2 连接而成的大分子复合物。分子量约为750kDa。其中C1q为具有识别作用的亚单位,C1r和C1s为具有催化作用的亚单位。 (一)C1q
C1q为各种补体分子中分子量最大(410kDa)的γ球蛋白。其分子结构较特殊和复杂,由A、B、C三种不同类型的肽链所组成。其中A、B、C链各6条,共18条。A、B、C三种肽链的分子量不尽相同,分别为24、23和22kDa,各含有222-226个氨基酸残基,且彼此同源。每条肽链由含半胱氨酸残基的一个短的N末端区所组成,接着为一段81个氨基酸的胶原序列(即重复的三股序列Gly-X-Y,Y处通常为羟脯氨酸或赖氨酸残基)。该序列的其余部分为非胶原性的。A、B链间及两条C链间各有一个二硫键相连接。18条肽链中每三条不同的肽链组成一条三股螺旋,故共有6条这样的结构。每条螺旋的肽链均由丝状胶原样成分组成。在6条螺旋结构C端由于氨基酸序列的随机卷曲而形成6个花蕾状的球形头部,呈花朵形展开。在近N端约为1/2全长的螺旋结构呈束状并平行排列,其N末端为C1q的尾部。
C1q的胶原样区有结合C1r和C1s的部位。并证实聚合的C1q刺激B细胞增强其产生Ig的作用,也是通过其尾部而完成的。C1q的关部含有能识别IgFc片段上补体结合部位的位点(C1q与C1q-R相互作用),且由于6个球形头部呈花朵形展开,更增加了其与Ig接触的机会。C1q同1个分子的IgM结合即可被活化,但至少需同两个IgG分子结合才能被活化,而且两个IgG分子在细胞膜上的距离不得少于700nm。C1q对人4种IgG亚类的结合亲和力依次为:IgG3>IgG1>IgG2>IgG4。
Reid等已对C1q分子的A、B链做了部分氨基酸分析,并完成了A、B链的cDNA克隆及序列分析。因此,C1q分子的大部分一级结构已经明确。编码C1qA、B、C三条肽链的基因均定位于人的第1号染色体的短臂34.1-36.1区。
(二)Clr和Cls
Clr和Cls均为单一多肽链分子,又都是丝氨酸蛋白酶(原)。Clr和Cls多肽链均由接近700个氨基酸所组成。位于C末端的约250个氨基酸为丝氨酸蛋白酶区,与胰蛋白酶和糜蛋白酶同源。同大多数补体蛋白一样,它们都是镶嵌(mosaic)蛋白,即由不同氨基酸组成的固定基序组合而成,并且很可能代表独立的折叠功能区或结构功能域(module)。
两个分子的Clr和同等分了的Cls借Ca2 连接成扭曲的“8”字形,盘架于C1q近头部的6条螺旋结构间。Clr和Cls的分子量条螺旋结构间。Clr和Cls的分子量均为85kDa。它们激活后,在分子内的精氨酸与亮氨酸残基间断裂,形成分子量分别为57kDa和28kDa的A、B两个片段,但链间仍以二硫键相连接,故整个分子并末分离。在B片段上含有丝氨酸蛋白酶活性点,为其催化英勇区。A片段上有Clr和Cls相互反应的的功能区。反应功能区朝向中心,催化功能区位于外侧。在一般C1INH与C1r结合着,而一旦有免疫复合物结合到Clq时,C1INH的抑制作用即行移除,并通过C1q的胶原性柄将其头部的移动传递到其核心区,并从此处再传递到与其相连接的C1r,诱导C1r构象改变并裂解活化。活化的C1r(C1r),再作用于C1s使之成为活化型C1s(C1s)。
C1r和C1s的cDNA克隆均已成功,并进行了全部序列分析。编码C1r的基因定位于人的第12号染色体短臂13-ter,与编码C1s的基因相连。

C4分子

C4是经典激活途径中第二个被活化的补体成分,分子量约为210kDa,由α(90kDa)、β(78kDa)及γ(33kDa)三条肽链借二硫键连接组成C4的分子结构较为特殊,其α链中含有一个在半胱氨酸和谷氨酸残其间形成的内硫酯键。α链的N端有C1s丝氨酸蛋白酶的作用点。当C1s将C4α链的精氨酸-丙氨酸键(76-77位)裂解后,形成大小不等的两个片段。小片段C4a(8.6kDa)释放入液相中,其为一弱的过敏毒素,具有激酞样作用,可诱导肥大细胞释放组胺,增加血管的通透性引起局部渗出性炎症,但其活性不到C3a或C5a的1%。大的片段C4b其α`链的内硫酯键被水解,并暴露出一个自由的硫氢基和一个谷氨酰胺残基的高度反应性酰基,通过转酯反应而将C4b固定到膜固相上。但C4b只能在其产生处或附近部位结合,因高度反应性的酰基能迅速与H2O反应,生成稳定的无共价结合功能的羧基。 一个C1s丝氨酸蛋白酶可以裂解多个C4分子,但产生的C4b只有1/10能结合到膜固相上,而且其中也仅少数与C2结合。C4b的功能,除主要参与经典激活途径中C3转化酶(C4b2a)和C5转化酶(C4b2a3b)的形成进一步介导补体后续成分的级联反应外,还可通过与效应细胞膜上的CR1结合促进吞噬、调节补体活化,以及参与防止免疫复合物的沉积及中和病毒的作用。C4可能与免疫识别及维持免疫自稳功能也有关。
编码人C4的基因定位于第6号染色体的HLA-DR和HLA-B位点间一段基因组DNA上。C4由两个基因C4A*和C4B*所编码,因此血清中的C4分子也有两种类型即C4A和C4B,但二者具有高度同源性(仅有少数氨基酸不同)C4A*和C4B*的cDNA克隆均已成功并进行了序列分析。C4A、C4B、B因子及C2均属于MHC的第Ⅲ类分子。

C2分子

C2的序号似是补体的第2个成分,但在经典激活途径的激活顺序上却在C4以后被活化。C2分子的一级结构已全部搞清楚,它是由723个氨基酸残基组成的单肽链糖蛋白,分子量约110kDa。当C2与已固定于细胞膜固相上的C4b结合为复合物时,C1s丝氨酸蛋白酶可从C2肽链的精氨酸赖氨酸(223-234)间,将C2裂解为两个片段,即C2a和C2b。C2b由N端223个氨基酸残基构成,分子量为35kDa,由细胞膜表面释放入液相中,其生物学活性至今不明。C2a由509个氨基酸残基组成,分子量为75kDa,它是构成经典激活途径中C3转化酶(C4b2a)和C5转化酶(C4b2a3b)的酶原部分。C2a的肽链上含有裂解C3和C5的蛋白酶活性点,C3转化酶与C5转化酶对C3和C5的裂解,均是由C2a的酶活性点起催化作用。

C3分子

C3处于两条激活途径的汇合点,在补体系统活化过程中起着枢纽作用,并为替代途径激活的关键分子。C3的α、β两条肽链组成,之间以二硫键相连结,分子量为195kDa,其中α链为115kDa,β链为75kDa。其在血清中的含量高于其它补体分子,约为0.55-1.2mg/ml。同C4分子一样,C3分子的α链在半胱氨酸和谷氨酸残基之间也有一个内硫酯键(Cys-S-CO-Glu)。此环状结构水解后,可形成一个转移性结合点,认为这是C3b由液相结合到固相上的结构条件,也是C3以缓慢的速率水解导致其构象改变出现能与B因子具有亲和力的“变构”C3b的分子基础。当C3转化酶从C3α链N端一个精氨酸-丝氨酸键(第77-78位)外将C3裂解后,可产生一个9kDa的小片段C3a(释放到液相中去),其余部分为C3b。同时,新生的C3bα`链内距N端5kDa的硫酯键断裂,在谷氨酰胺基上出现一个具有转酯作用的高度或多糖等分子中的羟基(R-OH)共价结合,形成新的酯键。同样,也可与靶细胞上的氨基形成酰键(-CONH-)。这样,新生的C3b便可结合于靶细胞表面,而其半胱氨酸则通过接受1个质子形成硫氢基(-SH),从而获得转移性。需要提及的是,上述形成的反应性酰基极不稳定,若在60秒内未同碳水化物发生转酯反应,则反应性酰基即与水分子反应形成羧基,从而使C3b失去共价结合的能力。一般细胞表面都有足够的糖类(常以糖蛋白、糖脂或多糖形式存在)因此新生C3b得以通过上述转酯作用而固定于细胞上(外来的或自身的)。通过上述转酯反应而获得结合活性的C3b可与c4b2a结合形成经典途径的C5转化酶(C4b2a3b),或与Bb结合形成替代途径的C3转化酶(C3bBb)和C5转化酶(C3bnBbC3b也可在H因子和I因子的作用下,变为无活性的C3bi,并再I因子裂解为C3dg和C3c。C3d可能是C3裂解的最终产物,只有在细菌或炎灶分解产物的作用下,才能裂解为C3d和C3c。还报道有C3e片段,可能来源于C3c。 C3各个裂解片段的生物学活性不一。C3a为过敏毒素,能直接作用于肥大细胞和嗜性粒细胞,使之释放组胺,引起血管扩张,通透性增加,平滑肌收缩及局部水肿。但其作用远较C5a弱。此外,C3a还具有使吞噬细胞定向移动以促进吞噬的趋化作用,以及抑制特异抗体反应、非特异性多克隆反应和抑制白细胞移动抑制因子(LIF)产生的作用。C3b的生物学活性烄广,概括起来有以下几个方面:(1)参与替代途径中两种C3转化酶[起始C3转化酶(C3bB)和放大C3转化酶(C3bBb),以及两条途径中两种C5转化酶(C4b2a3b和C3bnBb)的形成;(2)启动替代激活途径中的正反馈放大回路;(3)调理促进吞噬及免疫粘连作用;(4)参与免疫调节,如作为B细胞活化的非特异性刺激信号,作为B细胞的致有丝分裂原促进B细胞增殖,与抗体协同增强ADCC作用和刺激单核细胞释放前列腺素E(PGE),嵌入抗原、抗体复合物的网格结构中,使二者的结合键断裂从而是产生对可溶性免疫复合物的溶解作用等。C3bi具有促进吞噬和与抗体协同增强ADCC反应的作用。C3c和C3dg可的抑制抗原、有丝分裂原或同种异型抗原诱导的T细胞增殖,C3e则可引起白细胞增多。
人的C3基因定位于第19号染色体,有两种常见的同种型C3S和C3F。此外还有十余种少见型及罕见型,其中C3F与肾小球毛细血管性肾炎和部分脂质性营养不良有关。C3遗传性缺陷少见,但如发生缺陷,则易引起反复化脓性和革兰氏阴性菌的感染。

C5分子

C5是形成膜攻击复合体(MAC)的第1个补体分子。C5由以二硫键相连接的α、β链组成,分子量190kDa,其中α链为115kDa,β链为75kDa。C5与C3和C4的结构相类似,但没有链内硫酯键。靠近N端的第74-75位精氨酸一亮氨酸键为C5转化酶作用的部位。在C5转化酶的作用下,C5α链N末端裂解出一个分子量为11kDa的小片段C5a进入液相中,其余部分为110kDa的大片段C5b,仍结合在细胞膜表面。亲生的C5b在极短时间内能保持与C6结合的构象,可与C6非共价结合形成一牢固的C5b6复合物,并通过与C3b的可逆性结合而固定的细胞膜上。但C5b生成后其潜在的生物学活性存在时间非常短促,若无C6结合则迅速衰变为C5bi。 C5b只形成MAC参与细胞溶解效应,而C5a却具有广泛的生物学活性。概括起来有以下几方面:(1)过敏毒素作用:C5a是具有过敏毒素作用的补体裂解片段中作用最强的介质,较C3a强20倍,较C4a强2500倍。此外,C5a还可不依赖于肥大细胞释放组胺,即通过直接作用于血管内皮细胞而增加血管的通透性。(2)趋化作用:高浓度的C5a是中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和单核细胞的趋化剂,可刺激这些细胞沿着浓度定向移动。值得注意的是,被血清羧肽酶N切C5aC端精氨酸残基而形成的去精C5a虽丧失了使肥大细胞分泌组胺的能力,但仍具有较强的趋化活性,是补体活化后产生趋化作用的主要因素。(3)促代谢作用:高浓度的C5a可刺激中性粒细胞和单核细胞的氧化代谢,提高其cGMP的水平,有利于促进溶酶体与细胞膜的融合,释放溶酶体酶。此外,C5a还可刺激中性粒细胞粘附及增强其产生超氧化物。(4)免疫调节作用:近年体外研究表明,C5a对免疫应答有明显增强作用,如可诱导单核细胞分泌IL-1、IL-6、IL-8及TNF-α等细胞因子,促进抗原及同种异体抗原诱导的T细胞增殖及B细胞产生抗体等。C5a的上述生物学活性的利于增强机体的防御机能,但由其导致的炎症反应也可造成对机体的损伤。编码入C5的基因定位于第9号染色体长臂32-34区。

C6和C7

C6和C7有许多相似之处,均为单链糖蛋白,且分子量也相近分别为128kDa和121kDa。编码C6和C7分子的基因可能由共同的祖基因进化而来。C6和C7在氨基酸水平上有33.5%的同源性。对C6的结构及功能进行了较深入的研究,由cDNA序列推导成熟C6的全部多肽链含有913个氨基残基,前面还有21个独特氨基酸残基组成的信号肽,其碳水化物的含量为4-6%。在肽链的第303位和834位氨基酸残基处,可能为两个天冬酰胺连接的糖基化部位。C6中还含有大量的半胱氨酸残基(总数为64个),集中在多肽链的氨基末端和羧基末端部分,其中氨基末端的位置由半胱氨酸残基所占据。 C6和C7中都含有低密度脂蛋白(LDL)受体结构功能域、EGF前体结构功能域、Ⅰ型凝血敏感蛋白(TSP-1)结构功能域和SCR结构功能域,且排列方式相同。应用滤纸结合的C6片段进行研究表明,C6与C5b的结合部位为由2个SCR和2个Ⅰ因子结构功能域(FIMs)所组成的大小为34kDa的羧基末端的片段。在C6和C7活化过程中,二者均无分子的裂解,推测可能是由于其分子构型的改变而成为具有结合活性的形式。C6和C5b以非共价形式结合形成的C5b6复合物仍疏松的与C3b呈可逆性结合,且具有亲水性不能插入膜内。而一经与C7结合,即出现亲水-疏水两性转换,同时产生亚稳态膜结合部位。这样,c5b67便脱离C3b附着部位转移至膜表面,然后通过复合物中C7的疏水性紧紧固定在膜脂质双层中。疏水区的暴露系由于C5b67复合物的构象变化所致。但新生的亚稳态C5b67复合物仅有100毫秒的生存其,如不及时同膜结合,又可因复合物重排使疏小区折叠而失去膜结合活性。此外,无论液相或结合到膜上的C5b67复合物均可自行聚合而丧失其介导的溶细胞活性,但仍具有趋化作用。C6和C7可能还有触发淋巴细胞母细胞化的作用,因在单相混合淋巴细胞反应(MLR)中,加入抗C6及C7的抗体Fab能抑制淋巴细胞增殖。
编码C6和C7和的基因定位于人的第5号染色体上且相连锁。C6及C7均具有遗传多态性,编码C6的两个等位基因(C6A和C6B)已确定,东方人群中C6B的基因频率较高。C6及C7的cDNA已克隆成功,发现它们与C8和C9具有一定的同源性。

C8分子

C8是由α、β、γ三条肽链组成的三聚体糖蛋白,分子量为155kDa。其中α链和β链均为64kDa,γ链为22kDa。α链和γ链间以二硫键共价结合,而α链与β链间则为非共价键结合。C8分子中也含有TSP-1和LDL受体结构功能域。在C8α和C8β多肽链的中央(157-501个氨基酸残基间),几科不含半胱氨酸残基,为与细胞毒性T细胞及NK细胞产生的穿孔蛋白(perforin)有同源性的结构功能域。在α和β链中含有极高比使的疏水性氨基酸。β链分布在C8分子的表面,其与C5b的相互作用是极性的,并具有高度特异性。C8与C5b-7的结合部位为其β链。当C8与c5b-7结合后,通过C8分子的构象变化,使其α链插入膜脂质双层的烃核中,形成直径约1.6nm的空膜孔道,可使细胞同的离子缓缓流出,但不会导致细胞溶解。C5b-8复合物能促使C9的聚合但机理尚不清楚,可能是降低了C9聚合的活化能所致。另外研究表明,C9是通过C8而同c5b-8结合的,因C9不能同C5b-7相结合,而其同C5b-8的结合则可被抗C8的抗体所抑制。 C8的基因定位较复杂,其中编码α链和β链的基因C8A和C8B定位于人的第1号染色体,而编码γ链的基因C8G则定位于第9号染色体的长臂。目前已对C8β链的cDNA克隆成功,并做了序列分析,发现其与C9具有高度的同源性,而且二者均含有丰富的半胱氨酸的膜嵌入区。C8的α链和β链在遗传上也呈高度多态性,二者约有33%的氨基酸序列相同,而与C7和C9则约25%相同

C9分子

C9是形成膜攻击复合体(MAC)的最后个分子,为一单链糖蛋白,分子量79kDa。经对cDNA推导的氨基酸序列分析发现,C9为一两性分子。C端37kDa由疏水性氨基酸组成称C9b,N端34kDa由亲水性氨基酸组成称C9a因此C9以其羧基端部分嵌入细胞膜的脂质双层中。而N端则为与c5b-8相结合的结构域。C9具有自发聚合的作用,但聚合很慢,在37℃下需3天才能完成,而在C>5b-8的催化下,10分钟内即可完成。由12-16个C9分子聚合形成的多聚体C9,可形成内径10nm、壁厚2nm的中空穿膜孔道嵌入膜内。孔道的内面由许多亲水性氨基酸残基和碳水化物组成,而与双层脂接触的管壁外面则是疏水性氨基酸残基。由于细胞内容物的外漏,最终可导致细胞溶解破坏。C9分子的多肽链与C8α和C8β结构上相类似,也含有TSP-1、LDL受体前体结构功能域及与穿孔蛋白同源的结构功能域。由于C9和穿孔蛋白在结构和功能上均非常相似,推测二者可能具有共同的祖基因。编码入C9的基因定位于第5号染色体上,末发现C9有多态性。

B因子

B因子(factorBBf)替代激活途径中的重要成分,由Blum于1959年首先发现。B因子为由733个氨基酸残基组成的单链糖蛋白(糖含量约7%),分子量93kDa。由于这些氨基酸的迂回折叠形成三个大小相近似的球形区。其中1个为Ba,其余两个呈哑铃状为Bb。Bb中靠近N端的一个球形区可同C3b结合,另一个球形区可能是催化区。在Mg2 存在的情况下,B因子可与C3b结合形成C3bB,被血清中的D因子裂解为分子量为33kDa的Ba和63kDa的Bb两个片段。后者3再与C3b结合形成替代途径的C3转化酶(c3bBb)和C5转化酶(C3bnBb)。两种酶中的Bb均具有丝氨酸蛋白酶活性,是裂解C3和C5的活性部位,但C3bBb和C3bnBb均不稳定,易衰变失去活性。

D因子

D因子是启动替代途径激活的重要成分,为由222个氨基酸残基组成的单链丝氨酸蛋白酶,分子量仅25kDa。D因子在血清中的浓度很低(1-2μg/ml),主要以活化形式而存在。但可能还有一种以酶原形式而存在的由239个氨基酸残基组成的D因子。具有活性的D因子(D)可能在第234-235位的精氨酸-赖氨酸键处将B因子裂解为Ba和Bb两个片段,从而启动替代途径的级联活化反应。D因子的部分cDNA已克隆成功,并进行了序列分析,发现其与其它几种丝氨酸蛋白酶(如胰蛋白酶、糜蛋白酶、纤溶酶及弱性蛋白酶)具有同源性。

P因子

P因子又称备解素(properdin),是替代途径中除C3以外最先发现的一种血浆蛋白,P因子以聚合体形式而存在:即三聚体(54%)、二聚体(26%)和四聚体(20%)都有,但特异活性的顺序依次为:四聚体>三聚体>二聚体。P因子为由4条相同的肽链(分子量各55kDa)组成的四聚体分子,链间以非共价键相连接,分子量为220kDa。P因子的生物学活性是以高亲和力与c3bBb和C3bnBb相结合,结合后通过发生构象改变而加固C3b与Bb间的结合力,从而可使其半衰期由2分钟延长至26分钟。另外,P因子还可封闭H因子的抑制作用,更增加了上述两种酶的稳定性及活性,有利于促进替代途径级联反应的继续进行。因此,P因子实际上是替代途径中的一个重要的正调节分子。因其常成为c3bBb和C3bnBb复合物中的组成成分之一,故将其作为补体系统的固有成分在此一并描述。此外,在膜增生性肾小球肾炎病人血清中发现有一种C3肾炎因子(C3nephriticfactorC3NeF)实际为C3bBb的自身抗体,也可与C3bBb结合而增加c3bnBb的稳定性,使其半衰期处长10-30倍。

补体受体的结构及功能

1930年Duke和Wallace发现,被补体调理的结合到灵长类红细胞膜上的锥虫可产生免疫粘附现象。其后Nelson(1953)报道,与红细胞或中性粒细胞的免疫粘附只需要激活C3,而不需要激活具有溶解活性的补体末端成分,并将红细胞和中性粒细胞上具有免疫粘附作用的结构称为CR1。以后又相继发现了另外4种C3受体,即CR2(1973)、CR3(1979)、CR4(1984)和CR5(1984)。另外,还有4种补体受体则是根据它们的补体配体特异性而命名的,即C1q受体(C1q-R,1975).C5a的受体(C5a-R,1978)、C3a的受体(C3a-R,1979)和H因子的受体(fH-R,1980)等。

补体的灭活

使血液制品,特别是血清中的补体失去活性,不灭活补体的血液制品具有溶血作用,通过56度30分钟灭活后,补体失去活性,对细胞就没有破坏作用了。

受体结构

补体受体是细胞表面的重要膜结构。补体系统激活的级联反应产生的多种生物学效应, 诸如调理促吞噬作用、免疫调控作用、粘附作用、清除IC及炎症作用等,都是通过补受体而介导的。各种补体受体的细胞分布不尽相同,但其主要作用不外是识别配体、传导信号和诱导细胞应答等。

C1q受体

应用C1q-琼脂糖亲和层析由类淋巴母细胞和髓样细胞膜分离的C1q受体(C1q-R)为一种类似65kDa
补体

补体

的糖蛋白,具有非共价结合的蛋白聚糖成分。也可能还有CD43参与,从而构成一个多单位的糖蛋白复合体。由于各种细胞上表达的C1q-R具有类似的结合亲和力和与抗游离C1q抗体有共同的反应性,表明不同细胞上表达的C1q-R结构类似。C1q-R的某些肽段含有与RO/SSA(一种核糖核蛋白自身抗原)、舒网素、小鼠B50黑素瘤抗原、大鼠425蛋白等相似的序列,表明它们属于同一蛋白超家族。表达C1q-R的细胞类型B细胞及其母细胞株、NK细胞、单核-巨噬细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、内皮细胞、成纤维细胞及血小板等。最近报道,外周血T细胞及Molt4T淋巴细胞株也表达C1q-R。C1q-R的天然配体为C1q,C1q与C1q-R的相互作用具有特异性、可饱和性、可逆性及亲和性等特点。由于单独的C1q分子对C1q-R的亲和力很低,因此C1q-R常优先与免疫复合物(IC)结合的C1q相结合。C1q-R的功能主要有两方面:(1)免疫调节作用:C1q-R具有多种免疫增进作用,如促进B细胞产生Ig,促进吞噬细胞的ADCC效应及对IgC或C3bn/C4b包被颗粒的吞噬作用。通过鲁米诺化学发光法和检测磷酸已糖旁路的活化表明,刺激中性粒细胞的C1q-R可激发呼吸爆发,刺激内皮细胞的氧化代谢,促进IC的沉积与清除等。(2)调节血小板的功能:已证明游离的C1q与血小板上C1q-R相互作用可抑制胶原诱导的血小板聚集与释放反应,而结合于IC上成簇的C1q则可模拟胶原的作用,诱导血小板聚集和释放5-HT。此外,C1q-R与其配体的相互作用,还可刺激成纤维细胞趋化、DNA合成导致其增生。因此认为,在损伤愈合和组织再生中,C1q-R也可能起着重要作用。C1q-R复合体中的CD43可能起传导信号的作用。在促进过氧化物产生、增强吞噬作用和对不易吞噬的微生物的细胞毒作用中,C1q与中性粒细胞、单核-巨噬细胞和嗜酸性粒细胞上的FcR也可协同而发挥作用。

I型补体受体(CD35)

I型补体受体(CR1、C3b/C受体,又称CD35) 为单链穿膜糖蛋白,分子量160-260kDa。CRI有四种同种异型,其分子量与基因频率分别为,A:190kDa(0.83)、B:220kDa(0.16)、C:160kDa(0.01)和D:260kDa(0.002),但它们的功能相同。CR1广泛分布于红细胞、粒细胞、单核细胞、肥大细胞、滤泡树突状细胞、肾小球足突细胞、B细胞及部分CD4 T细胞。CR1的配体为C3b/C4b(高亲和力)及C3bi/C3c(低亲和力)。其主要功能有:(1)作为调理素受体,增强吞噬细胞对C3b/C4b包被颗粒及微生物的吞噬作用,以及对较小IC的内吞;(2)为I因子的辅助因子之一,协同I因子裂解C3b和C4b,抑制C3转化酶与C5转化酶的活性并促使其降解;(3)通过红细胞的CR1运送IC至肝脏等处经I因子裂解C3b,使IC与红细胞解离,再被单核细胞所清除;(4)为B细胞激活的调节剂。当CR1被含多个配体的IC交联时可激活B细胞,反之则产生抑制效应。并发现C1q-R与CR1在激活B细胞产生Ig的过程中有协同作用。有人认为CR1可通过将带有C3b或C3bi的抗原附着于B细胞表面而促进对抗原的识别。此外,CR还有促进NK细胞杀伤结合CR1(sCR1),存在于血浆中,正常值为13-81ng/ml。关于sCR1的来源,发现体外培养的中性粒细胞、单核细胞和淋巴细胞上清中有sCR1;将人的外周血白细胞移入严重免疫缺陷(SCID)小鼠体内后在其血清中也可检出sCR1,表明转移的白细胞可以合成sCR1。另外,通过以sCR1cDNA转染的COS细胞既可表达膜CR1,也可分泌sCR1,且与膜sCR1的分子量相同,说明sCR1由细胞分泌产生。血液中sCR1的水平与某此疾病具有一定的关联。发现sCR1水平升高与机体重要脏器的功能损害相平行,如晚期肾功衰竭和肝硬化的病人血液中sCR1的水平明显高于正常人,但经肾移植或肝移植后sCR1的水平可明显下降,甚至可降至正常水平。因此测定血中sCR1的水平对了解某些疾病的病情和判定治疗反应可能具有一定的意义。 sCR1的基因位于人的第1号染色体长臂32区,属于RCA家族中的成员。经对CR1N端的cDNA分析表明,CR1多肽结构有3-5个连接的蛋白片段,它们的内部序列有高度的同源性,称为长同源重复序列(longhomologousrepeat,LHR)。每个CR1的LHR在数目上的同种异型变异性,说明不同个体的CR1在大小有很大差别。此外,每个LHR由7个SCR组成。CR1最常见的形式有32个SCR,其中28个排列成4个LHR。每一个LHR的第2个SCR内具有同C3b/C4b相结合的部位。

Ⅱ型补体受体(CD21)

Ⅱ型补体受体(CR2)按白细胞分化抗原归类为CD21。CD2为分子量140kDa的单链糖蛋白,主要分布于B细胞、单核细胞、某些T细胞、咽上皮细胞及淋巴结滤泡树突状细胞上。其配体C3bg、C3d和C3bi中的C3d部分。CR2也是EB病毒的受体,CR2与C3d结合的部位和同EB病毒结合的部位相距甚远。另外,最近报道CR2还可与IFN-α结合。CR2主要功能是对B细胞的分化、增殖、记忆和Ig产生起重要的调节作用。如B细胞表面交联的C3d为B细胞由G1其进入到S期提供了活化信号,可取代单核因子的作用,而可溶性C3d则可通过与CR2结合而阻止B细胞化分。带有C3片段的IC可经CR2定位于生发中心激活记忆性B细胞。另外,多克隆和单克隆CR2的F(ab)2片段、C3bg-琼脂糖和EB病毒都能通过与CR2结合而引起B细胞活化。应用抗IgM抗体刺激B细胞可导致CR2磷酸化。而EB病毒则可借CR2感染B细胞(感染性单核细胞增多)或使B细胞或上皮细胞恶性转化,引起伯基特淋巴瘤或鼻咽癌。 CR2的基因定位于人第1号染色体上的长臂32区,也属于RCA家族成员。以cDNA探针的分子杂交研究表明,CR2与CR1的cDNA顺序有高度的同源性(包括20个氨基酸的信号肽、954个氨基酸的胞膜外区,24个氨基酸的穿膜区和34个氨基酸的胞浆区),以致CR1的一些cDNA探针,也可同CR2基因杂交。氨基酸序列分析表明,CR2也具有与CR1同样类型的SCR(15-16个)。

Ⅲ型补体受体(CD11b/CD18)

Ⅲ型补体受体(CR3)为由α、β两条肽链以非共价键结合而构成的异二聚体糖蛋白,分子量分别为165kDa和95kDa。CR3属于粘附分子整合素(integrin)家族中的成员,与淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)和CR4的结构极为相似,三者的β链完全相同(命名为CD18),而α链则各不相同:LFA-1为CD11a、CR3为CD11b、CD4为CD11c,故CR3又称为CD11b/CD18分子。CR3作为整合素家族中的成员,在炎症反应中可介导中性粒细胞粘附于内皮细胞。在体外某些情况下,CR3还可表达能同胶原蛋白、ICAM-1和血纤维蛋白原相结合的部位。经C5a刺激的吞噬细胞表达CR3和CR4可轻度增多,这有助于中性粒细胞粘附于血管内皮成为有粘附性细胞,由血管中游出至炎症部位。感染部位的CR3可将吞噬细胞连接到带有C3bi和/或β葡聚糖或LPS的细菌或酵母菌上,促进吞噬作用和呼吸爆发。另外,由于CR3最初是通过用Mac-1单克隆抗体的白细胞上发现的,因而也称其为Mac-1抗原。CR3和CR4对固相的C3bi具有相似的结合特异性,二者均需要有二价的阳离子参与,并均可被EDTA所抑制。与CD4不同的是,CR3还具有能与细菌LPS和酵母菌细胞壁上β葡聚糖相结合的部位,也需2价阳离子参与。CR3分布于中性粒细胞、单核-巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、NK细胞及细胞毒性T细胞和B细胞,其配体为C3bi。CR3的主要生物学活性是细胞粘附作用。它可促使效应细胞与靶细胞之间的密切接触增强吞噬作用,因而在抗感染免疫中具有重要作用。CR3的缺陷可出现反复细菌性感染。另外,CR3可能还是HIV-1感染细胞的入口之一,并可与β葡聚糖结合、激活补体,以及与大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、LPS及脂质A等结合。因此,CR3似乎是一种可结合多种配体的分子。CR3的α链和β链由不同染色体上的基因所编码。合成后在细胞膜装配成完整的CR3。遗传性CR3和CR4缺陷的病人,是因为编码它们共同β链的基因有缺陷,但在细胞浆中仍可检出正常α链的前体。

Ⅳ型补体受体

Ⅳ型补体受体(CR4)、又称CD11c/CD18,或P150,95,也是由α、β两条肽链借非共价键而结合的异二聚体糖蛋白,α链的分子量为150kDa,β链与CD3的β甸相同为95kDa. CR4主要分布于中性粒细胞、单核细胞、巨噬细胞和血小板上,其配体为C3bi和C3bg。CR4的功能是增强Fc受体介导的吞噬作用,但也可介导Fc受体非信赖性吞噬作用。在组织巨噬细胞上CR4呈优势表达,而只表达少量的CR1和CR3。吞噬细胞上表达的CR3和CR4分子,它们与细胞骨架的连接有别,这可调节两种受体介导颗粒附着与吞噬作用的能力。由于CR3受细胞骨架连接的限制较小,因此CR3的游动性较CR4大。这样便可使数量相对较少的CR3很快集聚在与C3bi包被颗粒相接触的部位,促使这些颗粒附着于巨噬细胞膜上。通过CR3将C3bi包被的颗粒捕获在吞噬细胞膜表面后,此时游动性较小但数量较多的CR4便可与C3bi包被的颗粒结合并促进吞噬作用。 编码CR4α链和β链基因分别定于第16号和第21号染色体上。经序列分析表明,CR4与CR3的α链有87%的同源性。

Ⅴ型补体受体

Ⅴ型补体受体受体(CR5)中C3bi中的C3d部分、C3dg和C3d片段的特性受体,但只能与液相中的上述片段起反应。CR5的生物学活性是通过125I标记的液相C3dg二聚体而被确定的。未标记的C3bi、C3dg与C3d对125I标记的C3dg二聚体的结合有竞争性抑制作用,而C3b则无此作用。曾认为中性粒细胞上的C3dg二聚体受体与该细胞上的红细胞-C3dg花环形成受体为同一受体,因此将其称为CR4。后来研究表明,能形成花环的受体活性在几种特性上与C3dg二聚体受体不同,如CR4与固定的C3bi的结合可被EDTA阻断,面EDTA对C3dg二聚体的摄取则无影响。因此将C3dg二聚体受体命名为CR5。除中性粒细胞外,在血小板上也已鉴定有CR5的活性。

生物学效应

(1)增强吞噬作用,增强吞噬细胞的趋化性;
(2)增加血管的通透性;
(3)中和病毒;
(4)细胞溶解作用;
(5)免疫反应的调节作用等。
生物学功能
(1)细胞毒作用
(2)调理作用和免疫粘附作用
(3)补体的中和及溶解病毒的作用
(4)炎症介质作用
(5)补体对免疫细胞的活化作用

补体实验室检查

1. 补体C3 (C3)
正常参考值:0.9—1.8 g/L
临床意义:C3增高常见于:各种传染病、急性炎症和组织损伤、急性肾炎、肝癌等,类风湿性关节炎患者正常或略有升高。C3降低常见于:免疫复合物引起的增殖性慢性肾小球肾炎(MPGN)、急性链球菌感染后肾小球肾炎(AGN)、狼疮性肾炎、反复性感染、皮疹、肝炎、肝硬化等严重肝脏疾患和关节疼痛等。
2. 补体C4 (C4)
正常参考值:0.1—0.4 g/L
临床意义:C4增高常见于:各种传染病、急性肾炎、组织损伤、多发性骨髓瘤等。C4降低常见于:免疫复合物引起的肾炎、系统性红斑狼疮、病毒性感染、狼疮性症候群、肝硬化、肝炎等。
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